🎨 Barwniki syntetyczne w żywności (HPLC)
Krótko: o co chodzi
Identyfikacja i oznaczanie ilościowe syntetycznych barwników spożywczych (tartrazyna, żółcień pomarańczowa, azorubina, czerwień Allura i in. Badanie wykonuje się według normy PN-EN 12878:2014 (oraz metody wewnętrzne oparte na HPLC-DAD); Zakres oznaczania: 0,5–500 mg/kg (zależnie od barwnika i matrycy). Procedura obejmuje 10 kroków (łącznie około 1 h 45 min); stosuje się je m.in. do: Kontrola urzędowa żywności przez Inspekcję Sanitarną (SANEPID), Kontrola jakości napojów gazowanych, soków, syropów, Badanie słodyczy, cukierków, żelków pod kątem barwników azowych.
W skrócie
- Norma: PN-EN 12878:2014 (oraz metody wewnętrzne oparte na HPLC-DAD)
- Kategoria: Chemia żywności
- Kroków procedury: 10
- Łączny czas etapów: 1 h 45 min
- Zakres oznaczania: 0,5–500 mg/kg (zależnie od barwnika i matrycy)
- Granica wykrywalności (LOD): 0,1–0,5 mg/kg
- Granica oznaczalności (LOQ): 0,5–1,0 mg/kg
Przegląd
Syntetyczne barwniki spożywcze (E100–E199) są jednymi z najczęściej kontrolowanych dodatków do żywności ze względu na potencjalne ryzyko zdrowotne — reakcje alergiczne, nadpobudliwość u dzieci (tzw. „Southampton six") i możliwe działanie kancerogenne niektórych azowych barwników. Rozporządzenie (WE) 1333/2008 określa dopuszczalne barwniki i ich maksymalne dawki w poszczególnych kategoriach żywności.
Metoda HPLC z detekcją UV-Vis (DAD — detektor diodowy) jest referencyjną techniką analityczną do jednoczesnej identyfikacji i oznaczania ilościowego wielu barwników syntetycznych w jednej analizie. Chromatografia odwróconych faz (RP-HPLC) na kolumnie C18 z elucją gradientową pozwala na rozdzielenie i ilościowe oznaczenie wszystkich dopuszczonych barwników syntetycznych w czasie ok. 20–30 minut.
Najczęściej oznaczane barwniki to: tartrazyna (E102), żółcień chinolinowa (E104), żółcień pomarańczowa (E110), azorubina (E122), pąs 4R (E124), czerwień Allura (E129), błękit brylantowy FCF (E133), indygotyna (E132) i zieleń S (E142). Metoda wymaga wstępnej ekstrakcji barwników z matrycy żywności, oczyszczenia na kartridżach SPE i analizy chromatograficznej.
Laboratoria akredytowane wykonujące te badania uczestniczą w programach badań biegłości (PT) organizowanych przez FAPAS i LGC, co zapewnia wiarygodność wyników na poziomie międzynarodowym.
Zasada metody
Barwniki syntetyczne są ekstrahowane z próbki żywności mieszaniną woda/metanol/amoniak, oczyszczane na kartridżach SPE (poliamid lub C18) i rozdzielane metodą chromatografii cieczowej na kolumnie C18 z elucją gradientową (faza ruchoma: bufor octanu amonu pH 7 / acetonitryl). Detekcja za pomocą detektora DAD (diode array detector) przy wielu długościach fali (427 nm, 482 nm, 520 nm, 630 nm) pozwala na identyfikację barwników na podstawie widma absorpcji i czasu retencji. Oznaczenie ilościowe — z krzywej kalibracyjnej wzorców.
Zastosowania
- Kontrola urzędowa żywności przez Inspekcję Sanitarną (SANEPID)
- Kontrola jakości napojów gazowanych, soków, syropów
- Badanie słodyczy, cukierków, żelków pod kątem barwników azowych
- Analiza przypraw i sosów (kurkumina vs tartrazyna)
- Kontrola żywności dla dzieci (ograniczenia UE — dodatkowe etykietowanie)
- Badania żywności importowanej pod kątem niedozwolonych barwników (Sudan I–IV)
- Monitoring barwników w suplementach diety
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Zakres oznaczania | 0,5–500 mg/kg (zależnie od barwnika i matrycy) |
| Granica wykrywalności (LOD) | 0,1–0,5 mg/kg |
| Granica oznaczalności (LOQ) | 0,5–1,0 mg/kg |
| Kolumna | C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) lub UHPLC C18 (100 × 2,1 mm, 1,8 µm) |
| Długości fali detekcji | 427, 482, 520, 630 nm (DAD: pełne widmo 200–700 nm) |
| Czas analizy | 20–30 min (HPLC), 8–12 min (UHPLC) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN 12878:2014 (oraz metody wewnętrzne oparte na HPLC-DAD)
- Tytuł (PL)
- Oznaczanie syntetycznych barwników w żywności metodą HPLC
- Title (EN)
- Determination of synthetic food colorants by HPLC
Procedura krok po kroku
-
Przygotowanie próbki
Zhomogenizuj próbkę żywności (blender). Odważ 2–5 g do kolby miarowej.
-
Ekstrakcja barwników
Dodaj 20 mL mieszaniny metanol/woda/amoniak (70:25:5). Umieść w łaźni ultradźwiękowej na 15 min. Przefiltruj.
-
Oczyszczanie SPE
Kondycjonuj kartridż SPE (5 mL metanolu, 5 mL wody). Nałóż ekstrakt. Płucz 5 mL wody. Elucja barwników 5 mL metanolem z amoniakiem.
-
Zatężenie i rozpuszczenie
Odparuj eluent do sucha pod strumieniem azotu (40°C). Rozpuść pozostałość w 1 mL fazy ruchomej A. Przefiltruj przez 0,22 µm do fiolki.
-
Przygotowanie wzorców
Sporządź krzywą kalibracyjną (5 punktów) z certyfikowanych wzorców barwników w zakresie 0,5–50 µg/mL.
-
Analiza HPLC
Wprowadź 10–20 µL próbki na kolumnę C18. Elucja gradientowa: 0→50% ACN w buforze octanu amonu pH 7 w 25 min. Przepływ 1,0 mL/min.
-
Detekcja i identyfikacja
Rejestruj chromatogram przy 427, 482, 520 i 630 nm. Identyfikuj barwniki po czasie retencji i widmie absorpcji UV-Vis (biblioteka widm DAD).
-
Oznaczenie ilościowe
Oblicz stężenie barwników z krzywej kalibracyjnej. Uwzględnij współczynnik rozcieńczenia i odzysk.
-
Kontrola jakości
Analizuj próbkę ślepą, próbkę z dodatkiem (spike) i CRM. Odzysk 90–110%, powtarzalność RSD ≤ 5%.
-
Raport
Sporządź sprawozdanie z wynikami w mg/kg, niepewnością i porównaniem z limitami wg Rozporządzenia 1333/2008.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| System HPLC z detektorem DAD | Agilent 1260 Infinity II + DAD G7117C, Shimadzu Nexera + SPD-M40, Waters Alliance + 2998 PDA | 150 000–350 000 PLN |
| Kolumna chromatograficzna C18 | Agilent Zorbax Eclipse Plus C18, Waters Symmetry C18, Phenomenex Kinetex C18 | 1 500–3 500 PLN |
| System SPE (ekstrakcja do fazy stałej) | Manifold SPE Supelco Visiprep, kartridże Oasis HLB lub poliamidowe | 2 000–5 000 PLN (manifold) |
| Łaźnia ultradźwiękowa | Bandelin Sonorex, Elma S, Branson 2800 | 3 000–8 000 PLN |
| Waga analityczna | Mettler Toledo MS205DU, RADWAG AS 220.R2 | 8 000–25 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Wzorce barwników (certyfikowane CRM) | — | Tartrazyna E102, żółcień pomarańczowa E110, azorubina E122, pąs 4R E124, czerwień Allura E129, błękit brylantowy E133 — Sigma-Aldrich, Dr. Ehrenstorfer |
| Acetonitryl (HPLC grade) | 75-05-8 | Czystość ≥ 99,9%, do fazy ruchomej i ekstrakcji |
| Metanol (HPLC grade) | 67-56-1 | Do ekstrakcji barwników z matrycy żywności |
| Octan amonu | 631-61-8 | Do przygotowania buforu fazy ruchomej (pH 7,0, stężenie 0,02 mol/L) |
| Amoniak 25% | 1336-21-6 | Do alkalizacji fazy ekstrakcyjnej — ułatwia rozpuszczanie barwników |
| Kartridże SPE (poliamid/C18) | — | Do oczyszczania ekstraktów z matryc tłuszczowych i białkowych, 500 mg/6 mL |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Acetonitryl — toksyczny (wdychanie, kontakt ze skórą), praca pod dygestorium
- Metanol — toksyczny, łatwopalny (temperatura zapłonu 11°C) — dygestorium, brak otwartego ognia
- Amoniak — żrący, drażniący drogi oddechowe — dygestorium, okulary, rękawice
- Wzorce barwników — niektóre azowe barwniki mogą być uczulające, stosować rękawice
- Odpady HPLC (faza ruchoma) — zbierać do pojemników na odpady organiczne
Najczęstsze pytania
Jaka norma opisuje to badanie?
Badanie wykonuje się według normy PN-EN 12878:2014 (oraz metody wewnętrzne oparte na HPLC-DAD) — „Oznaczanie syntetycznych barwników w żywności metodą HPLC”. Tytuł angielski: „Determination of synthetic food colorants by HPLC”.
Na czym polega ta metoda?
Barwniki syntetyczne są ekstrahowane z próbki żywności mieszaniną woda/metanol/amoniak, oczyszczane na kartridżach SPE (poliamid lub C18) i rozdzielane metodą chromatografii cieczowej na kolumnie C18 z elucją gradientową (faza ruchoma: bufor octanu amonu pH 7 / acetonitryl). Detekcja za pomocą detektora DAD (diode array detector) przy wielu długościach fali (427 nm, 482 nm, 520 nm, 630 nm) pozwala na identyfikację barwników na podstawie widma absorpcji i czasu retencji.
Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?
Zakres oznaczania: 0,5–500 mg/kg (zależnie od barwnika i matrycy); Granica wykrywalności (LOD): 0,1–0,5 mg/kg; Granica oznaczalności (LOQ): 0,5–1,0 mg/kg; Kolumna: C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm) lub UHPLC C18 (100 × 2,1 mm, 1,8 µm).
Ile trwa wykonanie badania?
Suma czasów podanych przy poszczególnych etapach to około 1 h 45 min. Procedura obejmuje 10 kroków.
Jaki sprzęt jest potrzebny?
System HPLC z detektorem DAD, Kolumna chromatograficzna C18, System SPE (ekstrakcja do fazy stałej), Łaźnia ultradźwiękowa, Waga analityczna. Orientacyjny koszt podstawowej aparatury (System HPLC z detektorem DAD): 150 000–350 000 PLN.
Gdzie stosuje się to badanie?
Kontrola urzędowa żywności przez Inspekcję Sanitarną (SANEPID); Kontrola jakości napojów gazowanych, soków, syropów; Badanie słodyczy, cukierków, żelków pod kątem barwników azowych; Analiza przypraw i sosów (kurkumina vs tartrazyna); Kontrola żywności dla dzieci (ograniczenia UE — dodatkowe etykietowanie); Badania żywności importowanej pod kątem niedozwolonych barwników (Sudan I–IV); Monitoring barwników w suplementach diety.
Jakie środki ostrożności obowiązują?
Acetonitryl — toksyczny (wdychanie, kontakt ze skórą), praca pod dygestorium; Metanol — toksyczny, łatwopalny (temperatura zapłonu 11°C) — dygestorium, brak otwartego ognia; Amoniak — żrący, drażniący drogi oddechowe — dygestorium, okulary, rękawice; Wzorce barwników — niektóre azowe barwniki mogą być uczulające, stosować rękawice; Odpady HPLC (faza ruchoma) — zbierać do pojemników na odpady organiczne.
Które laboratorium wykona to badanie?
Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN 12878.