🔴 Cronobacter spp. (mleko w proszku)

Mikrobiologia PN-EN ISO 22964

Przegląd

Cronobacter spp. (dawniej Enterobacter sakazakii) to patogen oportunistyczny stanowiący poważne zagrożenie dla noworodków i niemowląt, szczególnie wcześniaków i dzieci z obniżoną odpornością. Zakażenia Cronobacter mogą prowadzić do zapalenia opon mózgowych, posocznicy i martwiczego zapalenia jelit — śmiertelność sięga 40–80% u noworodków. Głównym źródłem zakażenia jest skażone mleko w proszku (preparaty do początkowego żywienia niemowląt — PIF).

Norma PN-EN ISO 22964 opisuje horyzontalną metodę wykrywania Cronobacter spp. w żywności, ze szczególnym uwzględnieniem mleka w proszku, preparatów dla niemowląt i próbek środowiskowych z zakładów produkcji tych produktów. Metoda obejmuje trzy etapy: wstępne namnażanie w wodzie peptonowej buforowanej (BPW), selektywne namnażanie w zmodyfikowanym bulionie laurylo-siarczynowo-tryptozowym z wankomycyną (mLST/vancomycin), oraz izolację na agarze chromogennym (CCI — Chromogenic Cronobacter Isolation Agar).

Cronobacter wykazuje charakterystyczną aktywność α-glukozydazy, która hydrolizuje substrat chromogenny w CCI agar, tworząc kolonie niebiesko-zielone (lub turkusowe). Wankomycyna w bulionie mLST hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich, umożliwiając selektywne namnożenie Cronobacter.

Cronobacter jest szczególnie niebezpieczny, ponieważ przeżywa w środowiskach o niskiej aktywności wodnej (mleko w proszku, mąki, herbatki ziołowe). Badanie jest wymagane przez Rozporządzenie (WE) nr 2073/2005 dla preparatów do początkowego żywienia niemowląt (kryterium: nieobecność w 10 g). Wynik „wykryto" skutkuje wycofaniem partii produktu z obrotu.

Zasada metody

Metoda trzyetapowa: (1) Wstępne namnażanie — 25 g próbki w 225 mL BPW, inkubacja 37°C/18 h — resuscytacja uszkodzonych komórek. (2) Namnażanie selektywne — 0,1 mL przesiew do 10 mL mLST z wankomycyną, inkubacja 44°C/24 h — selekcja Cronobacter (termofilny wzrost), wankomycyna hamuje Gram-dodatnie. (3) Izolacja — posiew na agar chromogenny CCI (Chromogenic Cronobacter Isolation Agar), inkubacja 44°C/24 h. Cronobacter produkuje α-glukozydazę, która hydrolizuje substrat chromogenny — kolonie niebiesko-zielone. Potwierdzenie: fermentacja cukrów, żółta pigmentacja na TSA, identyfikacja biochemiczna lub molekularna.

Zastosowania

• Kontrola jakości mleka w proszku dla niemowląt (PIF) — Rozporządzenie (WE) 2073/2005
• Badanie preparatów do początkowego żywienia niemowląt
• Monitoring środowiskowy zakładów produkcji mleka w proszku
• Kontrola surowców do produkcji preparatów dla niemowląt
• Badanie odżywek i żywności specjalnego przeznaczenia medycznego
• Monitoring herbat ziołowych, skrobi i mąk (rezerwuary Cronobacter)
• Walidacja procesów produkcyjnych i systemów mycia (CIP)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 22964:2017

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania Cronobacter spp.

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection of Cronobacter spp.

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie próbki

   Odważ 25 g mleka w proszku (PIF) do woreczka stomachera. Dodaj 225 mL wody peptonowej buforowanej (BPW) podgrzanej do 45°C. Wymieszaj do rozpuszczenia. Dla PIF bada się 10 × 25 g (łącznie 250 g).

   ⏱ Czas: 15 min • 🌡 Temperatura: 45°C

2. Wstępne namnażanie w BPW

   Inkubuj zawiesinę w 37 ± 1°C przez 18 ± 2 h. Faza resuscytacji — uszkodzone komórki Cronobacter odzyskują zdolność wzrostu.

   ⏱ Czas: 18 h • 🌡 Temperatura: 37°C

3. Selektywne namnażanie w mLST/wankomycyna

   Przenieś 0,1 mL namnożonej kultury do 10 mL bulionu mLST z wankomycyną (10 mg/L). Inkubuj 44 ± 1°C przez 24 ± 2 h.

   ⏱ Czas: 24 h • 🌡 Temperatura: 44°C

4. Izolacja na CCI agar

   Z pożółkłego bulionu mLST posiej eozę na płytkę CCI agar. Inkubuj 44 ± 1°C przez 24 ± 2 h.

   ⏱ Czas: 24 h • 🌡 Temperatura: 44°C

5. Odczyt kolonii

   Wyszukaj typowe kolonie Cronobacter — niebiesko-zielone (turkusowe), średnica 1–2 mm. Inne Enterobacteriaceae mogą rosnąć jako kolonie bezbarwne lub różowe.

   ⏱ Czas: 15 min

6. Potwierdzenie wstępne

   Wybierz min. 5 typowych kolonii. Przesiej na TSA i inkubuj 25°C przez 48–72 h. Cronobacter tworzy żółte/żółto-pomarańczowe kolonie (produkcja pigmentu).

   ⏱ Czas: 48–72 h • 🌡 Temperatura: 25°C

7. Identyfikacja biochemiczna

   Potwierdź izolaty za pomocą testów API 20E, VITEK 2 GN lub metod molekularnych (PCR). Cronobacter: oksydaza (−), katalaza (+), VP (+), argininowa dihydrolaza (−).

   ⏱ Czas: 24–48 h

8. Raportowanie

   Wynik: „Cronobacter spp. wykryto/nie wykryto w 25 g (lub 10 × 25 g) próbki". Wykrycie w PIF = natychmiastowe powiadomienie organów nadzoru i wycofanie partii.

   ⏱ Czas: 10 min

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Cronobacter — patogen BSL-2, szczególnie niebezpieczny dla noworodków i osób immunosupresyjnych
• Praca wyłącznie w komorze laminarnej klasy II — surowe przestrzeganie zasad aseptyki
• Wankomycyna — antybiotyk potencjalnie alergizujący, stosować rękawice
• Zużyte materiały autoklawować przed utylizacją (121°C/20 min)
• Dezynfekcja powierzchni 70% etanolem lub podchlorynem sodu 0,5%

Najczęstsze pytania