🧫 Ogólna liczba drobnoustrojów 30°C (TVC)
Krótko: o co chodzi
Metoda płytkowa (pour plate) do oznaczania ogólnej liczby drobnoustrojów mezofilnych tlenowych i fakultatywnie beztlenowych w żywności. Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 4833-1:2013; Zakres zliczania: 10–300 kolonii na szalkę. Procedura obejmuje 10 kroków (łącznie około 3 dni 1 h); stosuje się je m.in. do: Kontrola jakości żywności gotowej do spożycia, Badanie mleka i produktów mlecznych (kryterium higieny procesu), Kontrola mięsa i przetworów mięsnych.
W skrócie
- Norma: PN-EN ISO 4833-1:2013
- Kategoria: Mikrobiologia
- Kroków procedury: 10
- Łączny czas etapów: 3 dni 1 h
- Temperatura inkubacji: 30 ± 1°C
- Czas inkubacji: 72 ± 3 godziny
- Zakres zliczania: 10–300 kolonii na szalkę
Przegląd
Ogólna liczba drobnoustrojów (OLB/TVC — Total Viable Count) w temperaturze 30°C jest jednym z podstawowych wskaźników jakości mikrobiologicznej żywności. Nie jest to badanie na konkretne patogeny, lecz pomiar ogólnego zanieczyszczenia mikrobiologicznego — tzw. "higieny ogólnej" produktu.
Wysoka liczba drobnoustrojów wskazuje na: niedostateczną higienę produkcji, przerwanie łańcucha chłodniczego, zbyt długie przechowywanie, niewłaściwe warunki magazynowania lub wadliwą obróbkę termiczną.
Metoda płytkowa (pour plate) polega na zmieszaniu rozcieńczonej próbki z płynnym agarem PCA (Plate Count Agar), inkubacji w 30°C przez 72 godziny i policzeniu wyrosłych kolonii. Wynik wyrażany w jtk/g (jednostkach tworzących kolonie na gram).
Jest to metoda referencyjna wymagana przez Rozporządzenie (WE) 2073/2005 dla wielu kategorii żywności (produkty mleczne, gotowe do spożycia, mrożonki, soki).
Zasada metody
Metoda płytkowa zalewowa (pour plate): 1. Próbkę homogenizuje się i przygotowuje rozcieńczenia dziesiętne (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³...) w roztworze soli fizjologicznej z peptonem. 2. Po 1 mL każdego rozcieńczenia przenosi się do jałowej szalki Petriego. 3. Zalewa się ~15 mL płynnego agaru PCA (schłodzonego do 44–47°C). 4. Miesza ruchami kolistymi (8× w prawo, 8× w lewo) i pozostawia do zestalenia. 5. Inkubuje odwrócone szalki w 30±1°C przez 72±3 godziny. 6. Liczy kolonie na szalkach zawierających 10–300 kolonii.
Wynik [jtk/g] = średnia liczba kolonii × odwrotność rozcieńczenia.
Zastosowania
- Kontrola jakości żywności gotowej do spożycia
- Badanie mleka i produktów mlecznych (kryterium higieny procesu)
- Kontrola mięsa i przetworów mięsnych
- Badanie napojów, soków, wody butelkowanej
- Monitoring higieny zakładów produkcyjnych (wymazy)
- Kontrola surowców — ocena jakości mikrobiologicznej dostaw
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Temperatura inkubacji | 30 ± 1°C |
| Czas inkubacji | 72 ± 3 godziny |
| Zakres zliczania | 10–300 kolonii na szalkę |
| Jednostka wyniku | jtk/g lub jtk/mL (CFU/g) |
| Granica wykrywania | <10 jtk/g (przy rozcieńczeniu 10⁻¹) |
| Podłoże | PCA — Plate Count Agar (tryptono-glukozowy) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 4833-1:2013
- Tytuł (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drobnoustrojów — Część 1: Oznaczanie liczby metodą płytkową w temperaturze 30°C
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of microorganisms — Part 1: Colony count at 30°C by the pour plate technique
Procedura krok po kroku
-
Przygotowanie podłoża PCA
Rozpuść PCA w wodzie destylowanej. Sterylizuj w autoklawie 121°C/15 min. Schłódź w łaźni wodnej do 44–47°C (agar musi być płynny, ale nie gorący).
-
Przygotowanie próbki
Odważ 10 g próbki do worka stomachera. Dodaj 90 mL rozcieńczalnika (1:10 = rozcieńczenie 10⁻¹). Homogenizuj 1–2 min.
-
Seria rozcieńczeń
Przenieś 1 mL zawiesiny 10⁻¹ do 9 mL rozcieńczalnika → 10⁻². Powtórz: 10⁻³, 10⁻⁴... Użyj nowej pipety do każdego rozcieńczenia. Vorteksuj między transferami.
-
Posiew — przeniesienie na szalki
Przenieś po 1 mL z wybranych rozcieńczeń na jałowe szalki Petriego (2 szalki na rozcieńczenie = duplikat). Pracuj przy palniku lub w komorze laminarnej.
-
Zalewanie PCA
Na każdą szalkę nalej ~15 mL płynnego PCA (44–47°C). Sprawdź temp. wewnętrzną dłonią — ciepły, nie gorący. Natychmiast wymieszaj ruchami kolistymi: 8× CW, 8× CCW, 8× ↕, 8× ↔.
-
Zestalenie agaru
Pozostaw szalki na płaskiej powierzchni do całkowitego zestalenia (~15 min). Nie poruszać szalek w tym czasie!
-
Inkubacja
Odwróć szalki dnem do góry (zapobieganie kondensacji wody na koloniach). Inkubuj 30±1°C przez 72±3 godziny.
-
Zliczanie kolonii
Po 72h policz kolonie na szalkach zawierających 10–300 kolonii. Użyj licznika kolonii z lupą. Licz WSZYSTKIE kolonie — małe i duże, różnych morfologii.
-
Obliczenia
N = ΣC / [V × (n₁ + 0,1×n₂) × d], gdzie ΣC = suma kolonii, V = objętość inokulum (1 mL), n₁ = liczba szalek w niższym rozcieńczeniu, n₂ = w wyższym, d = niższe rozcieńczenie. Wynik w jtk/g.
-
Kontrola jakości
Szalka kontrolna (blank): sam agar PCA — brak wzrostu. Sprawdź sterylność rozcieńczalnika i podłoża co serię.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Inkubator 30±1°C | Memmert IN110, Binder BD 115, POL-EKO ST 2 | 5 000–15 000 PLN |
| Stomacher (homogenizator) | Seward Stomacher 400 Circulator | 12 000–25 000 PLN |
| Autoklaw | Tuttnauer 3870ELV | 30 000–80 000 PLN |
| Łaźnia wodna 44–47°C | GFL 1003, Memmert WNB 14 — do utrzymania PCA w stanie płynnym | 3 000–8 000 PLN |
| Pipety automatyczne 1 mL | Eppendorf Research Plus, Brand Transferpette S | 800–1 500 PLN |
| Szalki Petriego ø 90 mm | Jałowe, jednorazowe, polistyrenowe | 150–300 PLN / 500 szt. |
| Licznik kolonii | Interscience Scan 500, Stuart SC6+ | 3 000–15 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Plate Count Agar (PCA) | — | Tryptono-glukozowy agar: trypton 5 g + ekstrakt drożdżowy 2,5 g + glukoza 1 g + agar 15 g na litr. Merck 1.05463, Oxoid CM0325. |
| Rozcieńczalnik — sól fizjologiczna z peptonem | — | NaCl 8,5 g + pepton 1 g na litr wody. Merck 1.12535. Do rozcieńczeń dziesiętnych. |
| Probówki z rozcieńczalnikiem 9 mL | — | Jałowe, z zakrętkami, do rozcieńczeń 10⁻¹ do 10⁻⁶ |
| Worki do stomachera | — | Jałowe, z filtrem bocznym (BagFilter), 400 mL |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Próbki żywności — potencjalnie zawierają patogeny, stosować rękawice
- Gorący agar (~47°C) — ryzyko oparzenia
- Autoklaw — wysokie ciśnienie i temperatura, szkolenie obowiązkowe
- Odpady autoklawitować przed utylizacją (121°C/20 min)
- Praca w czystych warunkach — komora laminarna lub strefa przeznaczona
Materiały szkoleniowe i filmowe
Najczęstsze pytania
Jaka norma opisuje to badanie?
Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 4833-1:2013 — „Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drobnoustrojów — Część 1: Oznaczanie liczby metodą płytkową w temperaturze 30°C”. Tytuł angielski: „Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of microorganisms — Part 1: Colony count at 30°C by the pour plate technique”.
Na czym polega ta metoda?
Metoda płytkowa zalewowa (pour plate): 1. Próbkę homogenizuje się i przygotowuje rozcieńczenia dziesiętne (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³...
Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?
Temperatura inkubacji: 30 ± 1°C; Czas inkubacji: 72 ± 3 godziny; Zakres zliczania: 10–300 kolonii na szalkę; Jednostka wyniku: jtk/g lub jtk/mL (CFU/g).
Ile trwa wykonanie badania?
Suma czasów podanych przy poszczególnych etapach to około 3 dni 1 h. Procedura obejmuje 10 kroków.
Jaki sprzęt jest potrzebny?
Inkubator 30±1°C, Stomacher (homogenizator), Autoklaw, Łaźnia wodna 44–47°C, Pipety automatyczne 1 mL, Szalki Petriego ø 90 mm, Licznik kolonii. Orientacyjny koszt podstawowej aparatury (Inkubator 30±1°C): 5 000–15 000 PLN.
Gdzie stosuje się to badanie?
Kontrola jakości żywności gotowej do spożycia; Badanie mleka i produktów mlecznych (kryterium higieny procesu); Kontrola mięsa i przetworów mięsnych; Badanie napojów, soków, wody butelkowanej; Monitoring higieny zakładów produkcyjnych (wymazy); Kontrola surowców — ocena jakości mikrobiologicznej dostaw.
Jakie środki ostrożności obowiązują?
Próbki żywności — potencjalnie zawierają patogeny, stosować rękawice; Gorący agar (~47°C) — ryzyko oparzenia; Autoklaw — wysokie ciśnienie i temperatura, szkolenie obowiązkowe; Odpady autoklawitować przed utylizacją (121°C/20 min); Praca w czystych warunkach — komora laminarna lub strefa przeznaczona.
Które laboratorium wykona to badanie?
Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN ISO 4833-1.