🍄 Drożdże i pleśnie w żywności

Mikrobiologia PN-EN ISO 21527

Przegląd

Drożdże i pleśnie są wszechobecnymi organizmami odpowiedzialnymi za psucie się żywności — powodują zmiany smaku, zapachu, konsystencji i wyglądu produktów spożywczych. Niektóre pleśnie (Aspergillus, Penicillium, Fusarium) wytwarzają mykotoksyny — wtórne metabolity o działaniu kancerogennym, hepatotoksycznym, nefrotoksycznym i immunosupresyjnym (aflatoksyny, ochratoksyna A, deoksyniwalenol, zearalenon).

Norma PN-EN ISO 21527 składa się z dwóch części, dostosowanych do aktywności wodnej (aw) badanego produktu. Część 1 dotyczy produktów o aw > 0,95 (mleko, mięso, jaja, warzywa, owoce, świeże pasty) i wykorzystuje podłoże DRBC (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar). Część 2 dotyczy produktów o aw ≤ 0,95 (suszone owoce, ciasta, dżemy, suszone mięso, ryby solone, zboża, mąki, orzechy, przyprawy) i wykorzystuje podłoże DG18 (Dichloran 18% Glycerol Agar).

W obu przypadkach inkubacja odbywa się w 25 ± 1°C przez 5 dni (z możliwością przedłużenia do 7 dni). Dichloran i czerwień bengalska ograniczają rozrost szybko rosnących pleśni i zmniejszają rozmiar kolonii, umożliwiając zliczanie. Chloramfenikol hamuje wzrost bakterii. Glicerol w DG18 obniża aw podłoża, sprzyjając wzrostowi grzybów kseroflinych i osmofilnych.

Metoda jest szeroko stosowana w kontroli jakości żywności, monitoringu środowiskowym zakładów produkcyjnych oraz ocenie trwałości produktów. Nie obejmuje ona oznaczania zarodników pleśni ani identyfikacji gatunkowej grzybów — do tego potrzebne są metody mykologiczne.

Zasada metody

Próbkę posiewamy powierzchniowo na podłoże DRBC (aw > 0,95) lub DG18 (aw ≤ 0,95). Dichloran (2,6-dichloro-4-nitroanilina) ogranicza rozrost szybko rosnących pleśni (np. Rhizopus, Mucor). Czerwień bengalska dodatkowo zmniejsza rozmiar kolonii i ułatwia ich zliczanie. Chloramfenikol hamuje wzrost bakterii. W DG18 glicerol (18%) obniża aktywność wodną podłoża do ok. 0,955, co promuje wzrost drożdży osmofilnych i pleśni kserofilnych. Po inkubacji 5 dni w 25°C liczymy oddzielnie kolonie drożdży (gładkie, wilgotne, wypukłe) i pleśni (puszyste, włókniste, barwne).

Zastosowania

• Kontrola jakości owoców, warzyw i soków owocowych
• Badanie produktów zbożowych — mąka, kasza, płatki, pieczywo
• Monitoring produktów suszonych — orzechy, przyprawy, suszone owoce, herbatki ziołowe
• Kontrola jakości przetworów mlecznych — jogurty, sery, lody
• Badanie dżemów, konfitur, syropów i miodów
• Monitoring środowiskowy zakładów produkcyjnych (wymazówki, sedymentacja)
• Ocena trwałości mikrobiologicznej produktów spożywczych
• Kontrola kosmetyków i suplementów diety

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 21527-1:2009 / PN-EN ISO 21527-2:2009

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby drożdży i pleśni — Część 1: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wodnej powyżej 0,95 / Część 2: Metoda liczenia kolonii w produktach o aktywności wodnej ≤ 0,95

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0.95 / Part 2: Colony count technique in products with water activity ≤ 0.95

Procedura krok po kroku

1. Określenie aktywności wodnej produktu

   Zmierz aw próbki za pomocą miernika aktywności wodnej. Jeśli aw > 0,95 → użyj DRBC. Jeśli aw ≤ 0,95 → użyj DG18.

   ⏱ Czas: 10 min

2. Przygotowanie próbki

   Odważ 10 g próbki do woreczka stomachera, dodaj 90 mL wody peptonowej buforowanej, homogenizuj 60–120 s. Przygotuj rozcieńczenia dziesiętne.

   ⏱ Czas: 10 min

3. Przygotowanie podłoża

   Rozpuść odpowiednią ilość podłoża (DRBC lub DG18) w wodzie destylowanej. Sterylizuj w autoklawie (121°C/15 min). Schłodź do 47°C. Dodaj chloramfenikol. Rozlej na płytki (18–20 mL). Wysusz powierzchnię.

   ⏱ Czas: 45 min • 🌡 Temperatura: 47°C

4. Posiew powierzchniowy

   Nałóż 0,1 mL rozcieńczenia na powierzchnię płytki. Rozprowadź szpatułką Drigalskiego. Wykonaj duplikaty. Pozostaw do wchłonięcia inokulum.

   ⏱ Czas: 15 min

5. Inkubacja

   Inkubuj płytki w pozycji normalnej (dnem do dołu) w 25 ± 1°C. NIE odwracaj płytek — pleśnie rozrastałyby się na pokrywce.

   ⏱ Czas: 5 dni • 🌡 Temperatura: 25°C

6. Odczyt po 2–3 dniach (kontrolny)

   Sprawdź wzrost po 2–3 dniach. Zaznacz szybko rosnące pleśnie, które mogą utrudnić zliczanie po 5 dniach.

   ⏱ Czas: 10 min

7. Odczyt końcowy po 5 dniach

   Policz oddzielnie kolonie drożdży (gładkie, wilgotne, kremowe) i pleśni (puszyste, włókniste, barwne). Zliczaj płytki z 10–150 koloniami. Jeśli po 5 dniach wzrost jest słaby, przedłuż inkubację do 7 dni.

   ⏱ Czas: 20 min

8. Obliczenia

   Oblicz liczbę drożdży i pleśni oddzielnie (lub łącznie) jako średnią ważoną z duplikatów. Wynik wyraź w jtk/g.

9. Kontrola jakości

   Kontrola pozytywna: Saccharomyces cerevisiae (drożdże) i Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 (pleśnie). Kontrola jałowości podłoża.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Niektóre pleśnie wytwarzają mykotoksyny i alergeny — pracować w komorze laminarnej
• Zarodniki pleśni łatwo się unoszą — unikać gwałtownych ruchów przy otwieraniu płytek
• Chloramfenikol — potencjalnie szkodliwy, unikać kontaktu ze skórą i wdychania
• Dichloran — drażniący, stosować rękawice i fartuch
• Zużyte płytki z pleśniami autoklawować przed utylizacją (121°C/20 min)

Najczęstsze pytania