🦠 E. coli i bakterie grupy coli w wodzie — metoda NPL z podłożem enzymatycznym (Colilert-18 / Quanti-Tray)

Mikrobiologia PN-EN ISO 9308-2

Przegląd

Obecność i skala zanieczyszczenia kałowego to ważny czynnik oceny jakości wody i ryzyka zakażenia; badanie na obecność Escherichia coli, bytującej w jelitach ludzi i zwierząt stałocieplnych, wskazuje na takie zanieczyszczenie. Wynik dla bakterii grupy coli trudniej interpretować, bo część z nich żyje w glebie i wodach powierzchniowych — ich obecność nie dowodzi zanieczyszczenia kałowego, ale może wskazywać na niesprawność uzdatniania lub wniknięcie wody do sieci. ISO 9308-2:2012 (drugie wydanie, zastępujące ISO 9308-2:1990) określa metodę oznaczania ilościowego E. coli i bakterii grupy coli w wodzie opartą na wzroście w podłożu płynnym i obliczeniu najbardziej prawdopodobnej liczby (NPL) z tablic. Stosuje się ją do wszystkich rodzajów wody, także z dużą ilością zawiesiny i wysokim tłem bakterii heterotroficznych; nie wolno jej używać do oznaczania bakterii grupy coli w wodzie morskiej, a do E. coli w wodzie morskiej zwykle wymagane jest rozcieńczenie 1→10 w jałowej wodzie. Wykrywanie E. coli opiera się na ekspresji β-D-glukuronidazy, więc metoda nie wykrywa wielu szczepów enterokrwotocznych (np. O157), które tego enzymu zwykle nie wytwarzają — pojawiają się one jako bakterie grupy coli. Wynik jest potwierdzony bez dalszego potwierdzania dodatnich studzienek. ISO zwraca uwagę, że stosowanie normy może wiązać się z patentami IDEXX (Colilert-18, Quanti-Tray). W Polsce obowiązujące rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 22 maja 2026 r. w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi (Dz.U. 2026 poz. 748), zał. nr 4 cz. A pkt 1, wskazuje dla E. coli i bakterii grupy coli metodę referencyjną: norma PN-EN ISO 9308-1 LUB norma PN-EN ISO 9308-2 — obie równorzędnie. Tak samo stanowiło uchylone 24-06-2026 rozporządzenie z 7 grudnia 2017 r. (Dz.U. 2017 poz. 2294), więc zmiana aktu nie zmienia doboru normy.

Zasada metody

Do próbki wody (100 ml) lub rozcieńczenia uzupełnionego do 100 ml dodaje się jednorazowe opakowanie (snap pack) odwodnionego podłoża Colilert-18 (2,8 g), miesza do rozpuszczenia i aseptycznie rozlewa do tacki Quanti-Tray (do 201 organizmów/100 ml, 51 studzienek) lub Quanti-Tray/2000 (do 2419 organizmów/100 ml, 97 studzienek); tacki zgrzewa się w zgrzewarce Quanti-Tray i inkubuje w (36 ± 2) °C przez 18–22 h. Studzienki o barwie żółtej równej lub intensywniejszej niż komparator uznaje się za dodatnie dla bakterii grupy coli; żółte studzienki wykazujące jakąkolwiek fluorescencję w UV (365 nm) — za dodatnie dla E. coli. Żółte zabarwienie pochodzi z rozkładu orto-nitrofenylogalaktozydu (ONPG) przez β-D-galaktozydazę, a fluorescencja — z rozkładu 4-metyloumbeliferylo-glukuronidu (MUG) przez β-D-glukuronidazę do fluoryzującego metyloumbeliferonu. Bakteria grupy coli to członek Enterobacteriaceae wytwarzający β-D-galaktozydazę, E. coli — wytwarzający obie te enzymy. NPL na 100 ml odczytuje się z tablic statystycznych lub programu; dla tacki 51-studzienkowej NPL = N·ln[N/(N − X)]. Podłoże można też użyć w klasycznym układzie probówek NPL (np. 1 × 50 ml i 5 × 10 ml) albo jako test obecność/nieobecność w 100 ml — wtedy probówki wstępnie ogrzewa się 20 min w (36 ± 2) °C. Do rozcieńczeń używa się wyłącznie jałowej, nieinhibitującej wody bez utleniaczy (dejonizowanej lub wodociągowej); rozcieńczalniki buforowane, solankowe i peptonowe zakłócają test.

Zastosowania

• Monitoring wody do spożycia (metoda referencyjna wg rozporządzenia MZ z 22 maja 2026 r., Dz.U. 2026 poz. 748, zał. nr 4 cz. A pkt 1) i wody w sieciach dystrybucyjnych — szybki wynik po 18 h
• Wody o dużej zawartości zawiesiny i wysokim tle heterotrofów, gdzie filtracja membranowa zawodzi (wody powierzchniowe, surowe, studnie)
• Wody morskie i słonawe — oznaczanie E. coli po rozcieńczeniu 1→10 (bakterie grupy coli w wodzie morskiej wykluczone)
• Test obecność/nieobecność w 100 ml oraz klasyczny układ probówek NPL z tym samym podłożem
• Laboratoria stacji sanitarno-epidemiologicznych i wodociągów — brak potrzeby potwierdzania i liczenia kolonii

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 9308-2:2014-06 (ISO 9308-2:2012)

Tytuł (PL)

Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli — Część 2: Metoda najbardziej prawdopodobnej liczby

Title (EN)

Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria — Part 2: Most probable number method

Procedura krok po kroku

1. Pobór i transport

   Pobierz próbki wg ISO 19458, transportuj i przechowuj w (5 ± 3) °C; rozpocznij analizę w dniu poboru lub w ciągu 18 h (wyjątkowo do 24 h).

2. Dodanie podłoża

   Do 100 ml próbki (lub rozcieńczenia; woda morska zwykle 1→10 w jałowej wodzie) aseptycznie dodaj jedno opakowanie Colilert-18 (2,8 g) i delikatnie wstrząsaj do całkowitego rozpuszczenia.

3. Rozlanie i zgrzanie

   Wlej próbkę z podłożem do tacki Quanti-Tray lub Quanti-Tray/2000 i zgrzej w zgrzewarce; alternatywnie rozlej do jałowych probówek w układzie NPL (np. 1 × 50 ml i 5 × 10 ml) lub inkubuj całe 100 ml jako test obecność/nieobecność — wtedy ogrzej wstępnie 20 min w (36 ± 2) °C.

4. Inkubacja

   Inkubuj tacki 18–22 h w (36 ± 2) °C.

5. Odczyt

   Za dodatnie dla bakterii grupy coli uznaj studzienki o barwie żółtej co najmniej takiej jak komparator; obejrzyj tacki pod lampą UV 365 nm w ciemni — żółte studzienki z jakąkolwiek fluorescencją są dodatnie dla E. coli. Przy wątpliwym zabarwieniu po 18 h przedłuż inkubację do 22 h; wyniki dodatnie przed 18 h i ujemne po 22 h są ważne.

6. Obliczenie i sprawozdanie

   Z liczby dodatnich studzienek odczytaj NPL/100 ml dla bakterii grupy coli i E. coli z tablic B.1/B.2 lub programu; wynik „< 1” przy braku dodatnich (przy rozcieńczeniu 1→10 — „< 10”). Podaj metodę, identyfikację próbki, wynik i odstępstwa; stosuj kontrole dodatnie, ujemne i ślepe.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Praca z materiałem potencjalnie zawierającym patogeny jelitowe — zasady dobrej praktyki mikrobiologicznej, dezynfekcja i autoklawowanie zużytych tacek
• Lampa UV 365 nm — ochrona oczu i skóry podczas odczytu
• Zgrzewarka nagrzewa się — nie dotykaj elementów grzejnych

Najczęstsze pytania