🦠 E. coli i bakterie grupy coli w wodzie

Mikrobiologia PN-EN ISO 9308-1

Przegląd

Escherichia coli jest najważniejszym wskaźnikiem zanieczyszczenia kałowego wody. Obecność E. coli w wodzie pitnej świadczy o skażeniu odchodami ludzkimi lub zwierzęcymi i potencjalnym zagrożeniu chorobotwórczymi bakteriami, wirusami i pierwotniakami jelitowymi. Bakterie grupy coli (coliformy) obejmują szerszą grupę — oprócz E. coli także Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter — i służą jako ogólny wskaźnik higieny procesu uzdatniania.

Metoda według PN-EN ISO 9308-1 opiera się na filtracji membranowej próbki wody przez sączek o porowatości 0,45 µm, który zatrzymuje bakterie. Sączek umieszcza się na selektywnym podłożu chromogennym CCA (Chromogenic Coliform Agar), zawierającym substraty enzymatyczne: Salmon-GAL (6-chloro-3-indoksylo-β-D-galaktopiranozyd) dla β-galaktozydazy koliformów oraz X-Glukuronid (5-bromo-4-chloro-3-indoksylo-β-D-glukuronid) dla β-glukuronidazy E. coli.

Po inkubacji w 36±2°C przez 18–24 godzin kolonie koliformów wybarwiają się na kolor różowy do czerwonego (aktywność β-galaktozydazy), a kolonie E. coli na kolor ciemnoniebiesko-fioletowy (aktywność obu enzymów). Wynik odczytuje się bezpośrednio — bez konieczności potwierdzania biochemicznego, co znacznie przyspiesza analizę.

Metoda jest przeznaczona dla wód o małej florze towarzyszącej — wody pitnej, wody uzdatnionej, wody podziemnej. Dla wód powierzchniowych i ścieków (duża flora tła) stosuje się PN-EN ISO 9308-2 (metoda NPL z podłożem Colilert).

Zasada metody

Próbkę wody filtruje się przez membranę o porowatości 0,45 µm (średnica 47 mm), która zatrzymuje bakterie. Membranę przenosi się na powierzchnię podłoża chromogennego CCA. Podłoże zawiera dwa substraty chromogenne: Salmon-GAL rozszczepiany przez β-galaktozydazę (enzym koliformów) dając produkt o barwie łososiowo-różowej, oraz X-Glukuronid rozszczepiany przez β-glukuronidazę (enzym specyficzny dla E. coli) dając produkt ciemnoniebieski. Selektywność podłoża zapewnia Tergitol-7, który hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich i większości niekoliformów.

Zastosowania

• Kontrola jakości wody pitnej (Dz.U. 2017 — E. coli: 0 jtk/100 mL)
• Monitoring sieci wodociągowej — punkty poboru u konsumentów
• Badanie wód podziemnych i ujęć wodnych
• Kontrola wody po uzdatnianiu i dezynfekcji
• Badanie wody butelkowanej i źródlanej
• Monitoring wody w budynkach użyteczności publicznej (szpitale, szkoły)
• Woda do celów produkcyjnych w przemyśle spożywczym
• Badania poawaryjne — po awariach sieci wodociągowej

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 9308-1:2014+A1:2017

Tytuł (PL)

Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli — Część 1: Metoda filtracji membranowej do wód o małej ilości flory towarzyszącej

Title (EN)

Water quality — Enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria — Part 1: Membrane filtration method for waters with low bacterial background flora

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie stanowiska

   Wysterylizuj system filtracyjny (autoklaw 121°C/15 min lub płomień). Przygotuj płytki z podłożem CCA — wyjmij z lodówki 30 min wcześniej.

   ⏱ Czas: 30 min

2. Neutralizacja chloru

   Jeśli próbka zawiera chlor (woda sieciowa), dodaj tiosiarczan sodu (buforek 1,8% — 0,1 mL na 100 mL próbki). Wymieszaj delikatnie.

   ⏱ Czas: 2 min

3. Filtracja membranowa

   Umieść sterylny sączek 0,45 µm na lejku filtracyjnym. Nalej 100 mL próbki. Włącz pompę próżniową. Po przefiltrowaniu przepłucz lejek 20 mL sterylnej wody peptonowej.

   ⏱ Czas: 5 min

4. Przeniesienie sączka na podłoże

   Sterylną pęsetą przenieś sączek na płytkę CCA. Upewnij się, że sączek przylega równomiernie, bez pęcherzyków powietrza pod spodem.

   ⏱ Czas: 2 min

5. Inkubacja

   Inkubuj płytki odwrócone (dnem do góry) w inkubatorze 36±2°C przez 18–24 godziny. Nie przekraczaj 24 godzin.

   ⏱ Czas: 18–24 h • 🌡 Temperatura: 36 ± 2°C

6. Odczyt wyników — koliformy

   Policz kolonie różowe do czerwone (β-galaktozydazo-dodatnie) = bakterie grupy coli. Optymalna liczba: 10–100 kolonii na sączku.

   ⏱ Czas: 10 min

7. Odczyt wyników — E. coli

   Policz kolonie ciemnoniebieskie do fioletowych (β-galaktozydazo- i β-glukuronidazo-dodatnie) = E. coli. E. coli wchodzi w skład ogólnej liczby koliformów.

   ⏱ Czas: 10 min

8. Test oksydazowy (potwierdzenie)

   Przenieś podejrzane kolonie na pasek oksydazowy. E. coli jest oksydazo-ujemna (brak zmiany barwy). Kolonie oksydazo-dodatnie odrzuć.

   ⏱ Czas: 5 min

9. Obliczenie wyniku

   Wynik = liczba potwierdzonych kolonii na 100 mL próbki. Dla wody pitnej wymagany wynik: 0 jtk/100 mL zarówno dla E. coli, jak i koliformów.

10. Kontrola jakości

    Codziennie: kontrola negatywna (sterylna woda), kontrola pozytywna (szczep E. coli ATCC 25922, Enterobacter aerogenes ATCC 13048). Sprawdź sterylność podłoża.

    ⏱ Czas: 15 min

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Próbki wody mogą zawierać patogeny — pracować w rękawicach nitrylowych i fartuchu laboratoryjnym
• Podłoża z koloniami po inkubacji traktować jako materiał zakaźny — autoklaw przed utylizacją
• Praca przy palniku Bunsena — ryzyko oparzenia, nie zostawiać bez nadzoru
• Tiosiarczan sodu — niskie ryzyko, unikać kontaktu z oczami
• Lampa UV — nie patrzeć bezpośrednio w źródło promieniowania, ryzyko uszkodzenia wzroku

Najczęstsze pytania