🦠 E. coli β-glukuronidazo-dodatnie w żywności

Mikrobiologia PN-EN ISO 16649-2

Przegląd

Escherichia coli jest najważniejszym wskaźnikiem zanieczyszczenia kałowego żywności. Obecność E. coli w produkcie spożywczym świadczy o niedostatecznej higienie produkcji, niewłaściwej obróbce termicznej lub wtórnym skażeniu po pasteryzacji. Norma PN-EN ISO 16649-2 określa horyzontalną metodę oznaczania liczby E. coli β-glukuronidazo-dodatnich, wykorzystującą zdolność tych bakterii do rozkładu substratu chromogennego X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-glukuronidu).

Metoda opiera się na posiewie zalewowym (pour plate) na podłożu TBX (Tryptone Bile X-glucuronide Agar) i inkubacji w temperaturze 44°C przez 18–24 h. W tych warunkach E. coli tworzą charakterystyczne niebiesko-zielone kolonie dzięki aktywności enzymu β-glukuronidazy, który hydrolizuje chromogenny substrat. Około 96–97% szczepów E. coli wykazuje aktywność β-glukuronidazy, co czyni metodę wysoce swoistą.

Istotnym ograniczeniem metody jest fakt, że szczepy E. coli O157:H7 — jedne z najgroźniejszych patogenów pokarmowych — są przeważnie β-glukuronidazo-ujemne i nie są wykrywane tą metodą. Dlatego do wykrywania STEC/VTEC stosuje się odrębne metody (np. PN-EN ISO 13136). Metoda nie jest również odpowiednia dla wszystkich szczepów E. coli, które mogą słabo rosnąć w temperaturze 44°C.

Badanie jest wymagane przez polskie i unijne przepisy bezpieczeństwa żywności, w tym Rozporządzenie (WE) nr 2073/2005 w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dla środków spożywczych. Znajduje zastosowanie w kontroli jakości produktów mlecznych, mięsnych, warzyw, owoców morza oraz wody pitnej.

Zasada metody

Metoda wykorzystuje zdolność E. coli do produkcji enzymu β-glukuronidazy (GUD), który hydrolizuje substrat chromogenny 5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-glukuronid (X-Gluc) zawarty w podłożu TBX. Hydroliza uwalnia indoksyl, który ulega utlenieniu i dimeryzacji, tworząc nierozpuszczalny niebieski barwnik (5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indygo). Kolonie E. coli przybierają charakterystyczne niebiesko-zielone zabarwienie. Sole żółciowe obecne w podłożu hamują wzrost bakterii Gram-dodatnich, zapewniając selektywność. Inkubacja w 44°C dodatkowo ogranicza wzrost organizmów niebędących E. coli.

Zastosowania

• Kontrola jakości mikrobiologicznej żywności (mięso, nabiał, warzywa, owoce morza)
• Spełnienie wymagań Rozporządzenia (WE) nr 2073/2005 — kryteria mikrobiologiczne
• Monitoring higieny procesów produkcyjnych w zakładach spożywczych
• Badanie wody pitnej i wody używanej w produkcji żywności
• Kontrola skuteczności pasteryzacji i obróbki termicznej
• Weryfikacja systemów HACCP i GHP/GMP
• Badania urzędowe Inspekcji Sanitarnej i Inspekcji Weterynaryjnej

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 16649-2:2004

Tytuł (PL)

Mikrobiologia żywności i pasz — Horyzontalna metoda oznaczania liczby β-glukuronidazo-dodatnich Escherichia coli — Część 2: Metoda liczenia kolonii w temperaturze 44°C z zastosowaniem 5-bromo-4-chloro-3-indolylo-β-D-glukuronidu

Title (EN)

Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of beta-glucuronidase-positive Escherichia coli — Part 2: Colony-count technique at 44 degrees C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-glucuronide

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie próbki

   Odważ 25 g (lub 10 g) próbki do woreczka stomachera. Dodaj 225 mL (lub 90 mL) wody peptonowej buforowanej (BPW). Homogenizuj w stomacherze przez 60–120 s. Uzyskujesz rozcieńczenie 10⁻¹.

   ⏱ Czas: 5 min

2. Przygotowanie rozcieńczeń

   Przygotuj serię rozcieńczeń dziesiętnych (10⁻², 10⁻³, 10⁻⁴) przenosząc 1 mL do 9 mL rozcieńczalnika. Użyj nowej pipety do każdego rozcieńczenia.

   ⏱ Czas: 5 min

3. Posiew zalewowy

   Przenieś po 1 mL każdego rozcieńczenia na dwie sterylne płytki Petriego (duplikaty). W ciągu 15 min zalej ok. 15 mL podłoża TBX schłodzonego do 44–47°C.

   ⏱ Czas: 10 min • 🌡 Temperatura: 44–47°C

4. Mieszanie i zestalanie

   Delikatnie wymieszaj inokulum z podłożem ruchami kolistymi i wahliwymi. Pozostaw płytki na poziomej powierzchni do zestalenia agaru (ok. 10–15 min).

   ⏱ Czas: 15 min

5. Resuscytacja (opcjonalnie)

   Jeśli podejrzewasz uszkodzone komórki (np. mrożonki), inkubuj płytki 4 h w 37°C przed przeniesieniem do 44°C, aby umożliwić resuscytację.

   ⏱ Czas: 4 h • 🌡 Temperatura: 37°C

6. Inkubacja

   Odwróć płytki dnem do góry i inkubuj w 44 ± 1°C przez 18–24 h.

   ⏱ Czas: 18–24 h • 🌡 Temperatura: 44°C

7. Odczyt wyników

   Policz niebiesko-zielone kolonie typowe dla E. coli β-glukuronidazo-dodatnich. Zliczaj płytki zawierające 15–300 kolonii łącznie (typowe i nietypowe).

   ⏱ Czas: 15 min

8. Obliczenia

   Oblicz liczbę E. coli jako średnią ważoną z dwóch kolejnych rozcieńczeń wg wzoru: N = ΣC / (V × 1,1 × d), gdzie ΣC — suma kolonii, V — objętość posiewu, d — rozcieńczenie. Wynik wyraź w jtk/g lub jtk/mL.

9. Kontrola jakości

   Równolegle wykonaj kontrolę negatywną (podłoże bez posiewu) i kontrolę pozytywną (szczep referencyjny E. coli ATCC 25922). Sprawdź jałowość wody peptonowej.

10. Dokumentacja i raportowanie

    Zapisz wyniki w dzienniku laboratoryjnym, dołącz identyfikację próbki, numery partii podłoży, temperaturę inkubacji i obliczenia. Wynik raportuj jako jtk/g z podaniem niepewności pomiaru.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Praca z materiałem potencjalnie zakaźnym — stosować rękawice jednorazowe, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne
• Wszystkie czynności z otwartą próbką wykonywać w komorze laminarnej klasy II
• Zużyte podłoża i próbki autoklawować (121°C, 15 min) przed utylizacją
• Powierzchnie robocze dezynfekować 70% etanolem lub preparatem na bazie chloru
• Przestrzegać zasad aseptyki — ryzyko zakażenia E. coli enteropatogennymi

Najczęstsze pytania