🦠 Enterobacteriaceae w żywności

Mikrobiologia PN-EN ISO 21528-2

Krótko: o co chodzi

Oznaczanie liczby Enterobacteriaceae w żywności metodą posiewu zalewowego na agarze VRBG (Violet Red Bile Glucose) z nakładką, inkubacja 37°C przez 24 h. Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 21528-2:2017; Temperatura inkubacji: 37 ± 1°C. Procedura obejmuje 8 kroków (łącznie około 2 dni 50 min); stosuje się je m.in. do: Wskaźnik higieny produkcji żywności — Rozporządzenie (WE) nr 2073/2005, Kontrola jakości mleka w proszku i preparatów dla niemowląt, Monitoring wtórnego skażenia po pasteryzacji (post-pasteurization contamination).

W skrócie

Norma: PN-EN ISO 21528-2:2017
Kategoria: Mikrobiologia
Kroków procedury: 8
Łączny czas etapów: 2 dni 50 min
Temperatura inkubacji: 37 ± 1°C
Czas inkubacji: 24 ± 2 h
Podłoże: VRBG Agar (Violet Red Bile Glucose Agar)

Przegląd

Enterobacteriaceae to duża rodzina bakterii Gram-ujemnych obejmująca wiele rodzajów o znaczeniu sanitarnym i chorobotwórczym — Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Proteus, Serratia, Cronobacter i inne. Są one uznanym wskaźnikiem ogólnego stanu higieny produkcji żywności, uzupełniającym oznaczenie E. coli (wskaźnik zanieczyszczenia kałowego).

Norma PN-EN ISO 21528-2 opisuje horyzontalną metodę oznaczania liczby Enterobacteriaceae w żywności i próbkach środowiskowych. Metoda wykorzystuje podłoże VRBG (Violet Red Bile Glucose Agar) — selektywno-różnicujące podłoże, w którym fiolet krystaliczny i sole żółciowe hamują wzrost bakterii Gram-dodatnich i innych organizmów niebędących Enterobacteriaceae. Glukoza zastępuje laktozę (stosowaną w VRBL), dzięki czemu podłoże wykrywa wszystkich członków Enterobacteriaceae, nie tylko bakterie grupy coli.

Kolonie Enterobacteriaceae na VRBG są czerwone do ciemnopurpurowych, otoczone strefą precypitacji soli żółciowych. Metoda posiewu zalewowego z dodatkową warstwą nakładkową agaru zapewnia warunki zbliżone do anaerobowych, co hamuje wzrost bakterii niefermentujących Gram-ujemnych i promuje fermentację glukozy.

Metoda jest stosowana jako wskaźnik higieny w Rozporządzeniu (WE) nr 2073/2005, m.in. dla mleka w proszku, żywności dla niemowląt i produktów gotowych do spożycia. Jest szczególnie istotna w mleczarstwie, gdzie Enterobacteriaceae wskazują na potencjalne wtórne skażenie po pasteryzacji.

Zasada metody

Próbkę posiewamy zalewowo na podłoże VRBG. Sole żółciowe i fiolet krystaliczny hamują bakterie Gram-dodatnie. Enterobacteriaceae fermentują glukozę do kwasów, które w reakcji z czerwienią obojętną (Neutral Red) barwią kolonie na czerwono-purpurowo. Kwas powoduje także precypitację soli żółciowych wokół kolonii (halo). Po zalaniu, nakłada się dodatkową warstwę agaru VRBG (overlay), która ogranicza dostęp tlenu i hamuje wzrost bakterii tlenowych niefermentujących. Inkubacja w 37°C przez 24 h.

Zastosowania

Wskaźnik higieny produkcji żywności — Rozporządzenie (WE) nr 2073/2005
Kontrola jakości mleka w proszku i preparatów dla niemowląt
Monitoring wtórnego skażenia po pasteryzacji (post-pasteurization contamination)
Badanie produktów gotowych do spożycia (RTE)
Kontrola jakości mięsa i przetworów mięsnych
Monitoring środowiskowy zakładów produkcyjnych (powierzchnie, woda)
Weryfikacja skuteczności mycia i dezynfekcji linii produkcyjnych

Kluczowe parametry

Parametr	Wartość
Temperatura inkubacji	37 ± 1°C
Czas inkubacji	24 ± 2 h
Podłoże	VRBG Agar (Violet Red Bile Glucose Agar)
Typ kolonii	Czerwone do ciemnopurpurowych, z halo precypitacji soli żółciowych
Metoda posiewu	Zalewowy (pour plate) z nakładką (overlay)
Potwierdzenie	Test oksydazy (ujemny) + test fermentacji glukozy (dodatni)

Norma

Numer normy: PN-EN ISO 21528-2:2017
Tytuł (PL): Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Enterobacteriaceae — Część 2: Metoda liczenia kolonii
Title (EN): Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 2: Colony-count technique

Procedura krok po kroku

Przygotowanie próbki

Odważ 10 g próbki do woreczka stomachera, dodaj 90 mL BPW, homogenizuj 60–120 s. Przygotuj rozcieńczenia dziesiętne.

⏱ Czas: 10 min
Posiew zalewowy

Przenieś po 1 mL każdego rozcieńczenia na dwie sterylne płytki Petriego. W ciągu 15 min zalej ok. 10 mL podłoża VRBG schłodzonego do 44–47°C. Wymieszaj delikatnie ruchami kolistymi. Pozostaw do zestalenia.

⏱ Czas: 15 min • 🌡 Temperatura: 44–47°C
Nakładka (overlay)

Po zestaleniu agaru nałóż dodatkową warstwę ok. 10 mL podłoża VRBG (44–47°C) na powierzchnię. Pozostaw do zestalenia. Nakładka ogranicza dostęp tlenu.

⏱ Czas: 10 min • 🌡 Temperatura: 44–47°C
Inkubacja

Odwróć płytki i inkubuj w 37 ± 1°C przez 24 ± 2 h.

⏱ Czas: 24 h • 🌡 Temperatura: 37°C
Odczyt kolonii

Policz typowe kolonie — czerwone do ciemnopurpurowych, średnicy 0,5 mm lub większe, z halo precypitacji lub bez. Zliczaj płytki z 15–300 koloniami łącznie.

⏱ Czas: 15 min
Potwierdzenie (opcjonalnie)

Wybierz min. 5 typowych kolonii. Wykonaj test oksydazy (wynik ujemny = Enterobacteriaceae). Zaszczep na bulion glukozowy z rurką Durhama — inkubuj 24 h w 37°C (wynik: fermentacja glukozy + gaz).

⏱ Czas: 24 h • 🌡 Temperatura: 37°C
Obliczenia

Oblicz liczbę Enterobacteriaceae jako średnią ważoną. Jeśli wykonano potwierdzenie, uwzględnij odsetek potwierdzonych kolonii. Wynik wyraź w jtk/g.
Kontrola jakości

Kontrola pozytywna: E. coli ATCC 25922 (kolonie typowe, oksydaza-ujemne). Kontrola negatywna: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (brak wzrostu lub kolonie atypowe, oksydaza-dodatnia). Kontrola jałowości podłoża.

Wymagany sprzęt i aparatura

Sprzęt	Przykład	Orientacyjna cena
Inkubator laboratoryjny 37°C	Binder BD 56, Memmert INB 200, POL-EKO CLN 53	5 000–18 000 PLN
Łaźnia wodna 44–47°C	Memmert WNB 14, Julabo TW 12, POL-EKO LW-4	3 000–10 000 PLN
Komora laminarna klasy II	Thermo Scientific MSC-Advantage, ESCO Airstream	25 000–60 000 PLN
Stomacher / homogenizator	Seward Stomacher 400, Interscience BagMixer	12 000–25 000 PLN
Autoklaw laboratoryjny	Tuttnauer 2540M, Systec VX-65	15 000–45 000 PLN
Licznik kolonii	Interscience Scan 300, Stuart SC6+	3 000–15 000 PLN

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Odczynnik	CAS	Szczegóły
VRBG Agar (Violet Red Bile Glucose Agar)	548-62-9	Podłoże selektywno-różnicujące: pepton żelatynowy, ekstrakt drożdżowy, sole żółciowe, glukoza, fiolet krystaliczny, czerwień obojętna, NaCl, agar; op. 500 g
Fiolet krystaliczny (Crystal Violet)	548-62-9	Barwnik hamujący bakterie Gram-dodatnie; stężenie 0,002 g/L
Sole żółciowe (Bile Salts Mixture)	—	Czynnik selektywny hamujący bakterie Gram-dodatnie i niefermentujące; 1,5 g/L
Czerwień obojętna (Neutral Red)	553-24-2	Wskaźnik pH — barwi kolonie fermentujące glukozę na czerwono; 0,03 g/L
D-Glukoza	50-99-7	Źródło węgla fermentowane przez Enterobacteriaceae; 10 g/L
Bulion glukozowy (Glucose Broth)	—	Do testu fermentacji glukozy (potwierdzenie), z rurką Durhama
Odczynnik oksydazowy (Kovácsa)	—	Do testu oksydazy — Enterobacteriaceae oksydazo-ujemne; paski lub krople
Woda peptonowa buforowana (BPW)	—	Do rozcieńczeń próbki, op. 500 g

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

Rodzina Enterobacteriaceae obejmuje patogeny (Salmonella, E. coli) — stosować ŚOI
Praca w komorze laminarnej klasy II obowiązkowa
Fiolet krystaliczny — barwi skórę, stosować rękawice
Zużyte materiały autoklawować przed utylizacją (121°C/20 min)
Dezynfekcja powierzchni 70% etanolem lub podchlorynem sodu

Najczęstsze pytania

Jaka norma opisuje to badanie?

Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 21528-2:2017 — „Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Enterobacteriaceae — Część 2: Metoda liczenia kolonii”. Tytuł angielski: „Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae — Part 2: Colony-count technique”.

Na czym polega ta metoda?

Próbkę posiewamy zalewowo na podłoże VRBG. Sole żółciowe i fiolet krystaliczny hamują bakterie Gram-dodatnie.

Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?

Temperatura inkubacji: 37 ± 1°C; Czas inkubacji: 24 ± 2 h; Podłoże: VRBG Agar (Violet Red Bile Glucose Agar); Typ kolonii: Czerwone do ciemnopurpurowych, z halo precypitacji soli żółciowych.

Ile trwa wykonanie badania?

Suma czasów podanych przy poszczególnych etapach to około 2 dni 50 min. Procedura obejmuje 8 kroków.

Jaki sprzęt jest potrzebny?

Inkubator laboratoryjny 37°C, Łaźnia wodna 44–47°C, Komora laminarna klasy II, Stomacher / homogenizator, Autoklaw laboratoryjny, Licznik kolonii. Orientacyjny koszt podstawowej aparatury (Inkubator laboratoryjny 37°C): 5 000–18 000 PLN.

Gdzie stosuje się to badanie?

Wskaźnik higieny produkcji żywności — Rozporządzenie (WE) nr 2073/2005; Kontrola jakości mleka w proszku i preparatów dla niemowląt; Monitoring wtórnego skażenia po pasteryzacji (post-pasteurization contamination); Badanie produktów gotowych do spożycia (RTE); Kontrola jakości mięsa i przetworów mięsnych; Monitoring środowiskowy zakładów produkcyjnych (powierzchnie, woda); Weryfikacja skuteczności mycia i dezynfekcji linii produkcyjnych.

Jakie środki ostrożności obowiązują?

Rodzina Enterobacteriaceae obejmuje patogeny (Salmonella, E. coli) — stosować ŚOI; Praca w komorze laminarnej klasy II obowiązkowa; Fiolet krystaliczny — barwi skórę, stosować rękawice; Zużyte materiały autoklawować przed utylizacją (121°C/20 min); Dezynfekcja powierzchni 70% etanolem lub podchlorynem sodu.

Które laboratorium wykona to badanie?

Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN ISO 21528-2.

🔍 Znajdź laboratorium wykonujące to badanie