🦠 Enterokoki kałowe w wodzie
Krótko: o co chodzi
Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków jelitowych w wodzie metodą filtracji membranowej na podłożu Slanetza-Bartleya z potwierdzeniem na agarze żółciowo-eskulinowo-azydowym. Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 7899-2:2004; Wynik: jtk/100 mL (jednostki tworzące kolonie). Procedura obejmuje 10 kroków (łącznie około 1 dni 19 h 37 min–2 dni 3 h 37 min); stosuje się je m.in. do: Kontrola jakości wody pitnej (Dz.U. 2017 — enterokoki: 0 jtk/100 mL), Monitoring wód kąpieliskowych (Dyrektywa 2006/7/WE), Badanie wody butelkowanej i źródlanej.
W skrócie
- Norma: PN-EN ISO 7899-2:2004
- Kategoria: Mikrobiologia
- Kroków procedury: 10
- Łączny czas etapów: 1 dni 19 h 37 min–2 dni 3 h 37 min
- Wynik: jtk/100 mL (jednostki tworzące kolonie)
- Dopuszczalna wartość (woda pitna): 0 jtk/100 mL
- Temperatura izolacji: 36 ± 1°C (etap domniemany)
Przegląd
Enterokoki jelitowe (intestinal enterococci) to grupa bakterii z rodzaju Enterococcus — przede wszystkim E. faecalis i E. faecium — które naturalnie zasiedlają przewód pokarmowy ludzi i zwierząt ciepłokrwistych. Stanowią uznany wskaźnik zanieczyszczenia kałowego wody, komplementarny do E. coli, ale charakteryzujący się znacznie większą odpornością na warunki środowiskowe, chlorowanie i wysychanie.
Enterokoki są szczególnie cennym wskaźnikiem w sytuacjach, gdy E. coli może ulec szybkiej inaktywacji — w wodach morskich, wodach po intensywnej dezynfekcji, a także przy ocenie dawnego zanieczyszczenia kałowego. Przeżywalność enterokoków w środowisku wodnym jest dłuższa niż E. coli, co czyni je lepszym markerem skuteczności procesów uzdatniania.
Metoda według PN-EN ISO 7899-2 obejmuje dwa etapy: izolację domniemaną na podłożu Slanetza-Bartleya (agar z azydem sodu i chlorkiem trifenylotetrazoliowym — TTC) oraz potwierdzenie na agarze żółciowo-eskulinowo-azydowym (BEA). Enterokoki redukują TTC do czerwonego formazanu, tworząc charakterystyczne kolonie czerwone do bordowych. Na BEA hydrolizują eskulinę, dając ciemnobrązowe do czarne zabarwienie wokół kolonii.
Enterokoki są parametrem obligatoryjnym w badaniach wody pitnej (Rozporządzenie MZ) z dopuszczalną wartością 0 jtk/100 mL. Są również wymagane w monitoringu wód kąpieliskowych (Dyrektywa 2006/7/WE) i wód butelkowanych.
Zasada metody
Próbkę wody przesącza się przez membranę 0,45 µm, która zatrzymuje bakterie. Membranę umieszcza się na podłożu Slanetza-Bartleya i inkubuje w 36±1°C przez 40–48 h. Podłoże zawiera azydek sodu (inhibitor bakterii Gram-ujemnych) i chlorek 2,3,5-trifenylotetrazoliowy (TTC), który enterokoki redukują do nierozpuszczalnego czerwonego formazanu — kolonie domniemane mają barwę czerwoną, bordową lub różową. Następnie membranę przenosi się na agar żółciowo-eskulinowo-azydowy (BEA) i inkubuje w 44±0,5°C przez 2 h. Enterokoki hydrolizują glikozyd eskulinę do eskuletyny, która reaguje z jonami żelaza w podłożu, tworząc ciemnobrązowy do czarnego kompleks — potwierdzenie wyniku.
Zastosowania
- Kontrola jakości wody pitnej (Dz.U. 2017 — enterokoki: 0 jtk/100 mL)
- Monitoring wód kąpieliskowych (Dyrektywa 2006/7/WE)
- Badanie wody butelkowanej i źródlanej
- Ocena skuteczności dezynfekcji wody (chlorowanie, UV, ozonowanie)
- Monitoring wód morskich i słonawych — lepsza przeżywalność niż E. coli
- Badanie wód podziemnych i ujęć infiltracyjnych
- Kontrola jakości wody basenowej
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Wynik | jtk/100 mL (jednostki tworzące kolonie) |
| Dopuszczalna wartość (woda pitna) | 0 jtk/100 mL |
| Temperatura izolacji | 36 ± 1°C (etap domniemany) |
| Temperatura potwierdzenia | 44 ± 0,5°C (etap potwierdzający) |
| Czas inkubacji | 40–48 h (izolacja) + 2 h (potwierdzenie) |
| Objętość próbki | 100 mL (standardowo) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 7899-2:2004
- Tytuł (PL)
- Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych — Część 2: Metoda filtracji membranowej
- Title (EN)
- Water quality — Detection and enumeration of intestinal enterococci — Part 2: Membrane filtration method
Procedura krok po kroku
-
Przygotowanie stanowiska
Wysterylizuj system filtracyjny. Przygotuj płytki z podłożem Slanetza-Bartleya i BEA. Sprawdź temperaturę inkubatorów (36°C i 44°C).
-
Neutralizacja chloru
Dodaj tiosiarczan sodu do próbki zawierającej chlor resztkowy (buforek 1,8%). Wymieszaj delikatnie.
-
Filtracja membranowa
Umieść sterylny sączek 0,45 µm na lejku. Przefiltruj 100 mL próbki. Przepłucz lejek 20 mL sterylnej wody peptonowej.
-
Etap domniemany — Slanetz-Bartley
Przenieś sączek na podłoże Slanetza-Bartleya. Inkubuj w 36±1°C przez 40–48 godzin.
-
Odczyt kolonii domniemanych
Policz kolonie czerwone, bordowe lub różowe (redukcja TTC do formazanu). Odnotuj liczbę i rozmieszczenie kolonii.
-
Etap potwierdzający — BEA
Przenieś membranę z koloniami na powierzchnię agaru BEA (bez odwracania). Inkubuj w 44±0,5°C przez 2 godziny. Odczytaj natychmiast po inkubacji.
-
Odczyt kolonii potwierdzonych
Policz kolonie otoczone brązowo-czarną strefą (hydroliza eskuliny). Te kolonie = potwierdzone enterokoki jelitowe.
-
Obliczenie wyniku
Wynik = liczba potwierdzonych kolonii / objętość próbki × 100. Podaj wynik w jtk/100 mL.
-
Kontrola jakości
Kontrola pozytywna: szczep E. faecalis ATCC 29212. Kontrola negatywna: sterylna woda. Kontrola podłoży: sterylność i jałowość.
-
Utylizacja
Wszystkie płytki z koloniami autoklawuj (121°C/30 min) przed utylizacją jako odpady zakaźne.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| System filtracji membranowej | Sartorius Combisart, Merck EZ-Fit, Pall MicroFunnel | 3 000–12 000 PLN |
| Pompa próżniowa | KNF Laboport N 810, Sartorius 16612 | 3 000–8 000 PLN |
| Inkubator 36°C | Binder BD 56, Memmert IN30, Pol-Eko CLN 32 | 5 000–15 000 PLN |
| Inkubator 44°C (precyzyjny) | Binder BD 23 z regulacją ±0,5°C, Memmert IN30plus | 6 000–18 000 PLN |
| Autoklaw do sterylizacji | Tuttnauer ELV 2540, Systec VX-40 | 20 000–45 000 PLN |
| Lupa / licznik kolonii | Stuart SC6+, Interscience Scan 500 | 1 500–25 000 PLN |
| Komora laminarna | Esco Airstream, Telstar Bio II Advance | 15 000–40 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Agar Slanetza-Bartleya | — | Podłoże selektywne z azydem sodu i TTC do izolacji domniemanej enterokoków. Producenci: Merck, Oxoid, Biokar |
| Agar żółciowo-eskulinowo-azydowy (BEA) | — | Podłoże potwierdzające z żółcią wołową, eskuliną, cytrynu żelazowo-amonowym i azydem sodu |
| Sączki membranowe 0,45 µm | — | Celulozowe mieszane (MCE), średnica 47 mm, sterylne. Merck Millipore, Sartorius |
| Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazoliowy (TTC) | 298-96-4 | Suplement do podłoża Slanetza-Bartleya, stężenie 0,1 g/L |
| Azydek sodu (NaN₃) | 26628-22-8 | Inhibitor w podłożu, hamuje bakterie Gram-ujemne. UWAGA: silnie toksyczny! |
| Tiosiarczan sodu (Na₂S₂O₃) | 7772-98-7 | Do neutralizacji chloru w próbkach wody sieciowej |
| Roztwór Ringera (1/4 stężenia) | — | Do rozcieńczania próbek, sterylne buforki po 9 mL |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Azydek sodu (NaN₃) — silnie toksyczny (H300, H310, H330)! Śmiertelne dawki: 10 mg/kg. Pracować w wyciągu, rękawice, okulary
- Enterokoki mogą powodować zakażenia szpitalne (VRE) — pełne środki ochrony osobistej
- Materiał biologiczny po inkubacji — autoklaw 121°C/30 min przed utylizacją
- Praca przy palniku Bunsena — ryzyko oparzenia i poparzeń
- Woda morska/kąpieliskowa — możliwa obecność innych patogenów, zachować szczególną ostrożność
Najczęstsze pytania
Jaka norma opisuje to badanie?
Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 7899-2:2004 — „Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych — Część 2: Metoda filtracji membranowej”. Tytuł angielski: „Water quality — Detection and enumeration of intestinal enterococci — Part 2: Membrane filtration method”.
Na czym polega ta metoda?
Próbkę wody przesącza się przez membranę 0,45 µm, która zatrzymuje bakterie. Membranę umieszcza się na podłożu Slanetza-Bartleya i inkubuje w 36±1°C przez 40–48 h.
Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?
Wynik: jtk/100 mL (jednostki tworzące kolonie); Dopuszczalna wartość (woda pitna): 0 jtk/100 mL; Temperatura izolacji: 36 ± 1°C (etap domniemany); Temperatura potwierdzenia: 44 ± 0,5°C (etap potwierdzający).
Ile trwa wykonanie badania?
Suma czasów podanych przy poszczególnych etapach to około 1 dni 19 h 37 min–2 dni 3 h 37 min. Procedura obejmuje 10 kroków.
Jaki sprzęt jest potrzebny?
System filtracji membranowej, Pompa próżniowa, Inkubator 36°C, Inkubator 44°C (precyzyjny), Autoklaw do sterylizacji, Lupa / licznik kolonii, Komora laminarna. Orientacyjny koszt podstawowej aparatury (System filtracji membranowej): 3 000–12 000 PLN.
Gdzie stosuje się to badanie?
Kontrola jakości wody pitnej (Dz.U. 2017 — enterokoki: 0 jtk/100 mL); Monitoring wód kąpieliskowych (Dyrektywa 2006/7/WE); Badanie wody butelkowanej i źródlanej; Ocena skuteczności dezynfekcji wody (chlorowanie, UV, ozonowanie); Monitoring wód morskich i słonawych — lepsza przeżywalność niż E. coli; Badanie wód podziemnych i ujęć infiltracyjnych; Kontrola jakości wody basenowej.
Jakie środki ostrożności obowiązują?
Azydek sodu (NaN₃) — silnie toksyczny (H300, H310, H330)! Śmiertelne dawki: 10 mg/kg. Pracować w wyciągu, rękawice, okulary; Enterokoki mogą powodować zakażenia szpitalne (VRE) — pełne środki ochrony osobistej; Materiał biologiczny po inkubacji — autoklaw 121°C/30 min przed utylizacją; Praca przy palniku Bunsena — ryzyko oparzenia i poparzeń; Woda morska/kąpieliskowa — możliwa obecność innych patogenów, zachować szczególną ostrożność.
Które laboratorium wykona to badanie?
Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN ISO 7899-2.