🦠 Gronkowce koagulazo-dodatnie (S. aureus)

Mikrobiologia PN-EN ISO 6888-1

Przegląd

Staphylococcus aureus jest jednym z najczęstszych czynników bakteryjnych zatruć pokarmowych na świecie. Gronkowce koagulazo-dodatnie wytwarzają termostabilne enterotoksyny (SE A–E), które nie ulegają zniszczeniu nawet podczas obróbki termicznej żywności. Wystarczy ok. 100 ng enterotoksyny, aby wywołać objawy zatrucia u człowieka. Źródłem kontaminacji żywności jest najczęściej personel produkcyjny (nosicielstwo nosowe, zakażone rany na dłoniach).

Norma PN-EN ISO 6888-1 opisuje horyzontalną metodę oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich z zastosowaniem selektywnego podłoża Baird-Parkera. Podłoże zawiera tellurek potasu i chlorek litu jako czynniki hamujące wzrost bakterii towarzyszących, natomiast glicyna i pirogronian sodu stymulują wzrost gronkowców. Kolonie S. aureus na tym podłożu są czarne lub szare, lśniące i wypukłe, otoczone strefą przejaśnienia (redukcja tellurku do telluru metalicznego).

Metoda jest stosowana globalnie jako złoty standard w oznaczaniu gronkowców w żywności. Pozwala na jednoczesne oznaczanie liczebności i wstępną identyfikację na podstawie morfologii kolonii. Potwierdzenie wykonuje się testem koagulazy w probówce lub metodą RPFA (Rabbit Plasma Fibrinogen Agar).

Badanie jest obligatoryjne w ramach Rozporządzenia (WE) nr 2073/2005 dla serów, mleka w proszku, produktów gotowych do spożycia oraz żywności dla niemowląt. Jest kluczowym elementem systemów HACCP w zakładach mleczarskich, cukierniczych i gastronomicznych.

Zasada metody

Metoda polega na posiewie powierzchniowym próbki na selektywne podłoże Baird-Parkera wzbogacone emulsją żółtka jaja z tellurkiem potasu. Tellurek potasu (K₂TeO₃) jest redukowany przez gronkowce do telluru metalicznego, co nadaje koloniom charakterystyczne czarne zabarwienie. Chlorek litu i tellurek hamują wzrost większości bakterii towarzyszących. Lecytynaza produkowana przez S. aureus powoduje opalizację (strefa przejaśnienia) wokół kolonii. Lipaza rozkłada tłuszcze żółtka, tworząc zewnętrzny pierścień precypitacji. Po inkubacji 24–48 h w 34–38°C, typowe kolonie potwierdza się testem koagulazy.

Zastosowania

• Kontrola jakości serów i produktów mleczarskich
• Badanie żywności gotowej do spożycia (RTE) — kryteria Rozporządzenia (WE) 2073/2005
• Monitoring higieny produkcji w cukierniach i zakładach gastronomicznych
• Kontrola żywności dla niemowląt i małych dzieci
• Badanie mięsa i przetworów mięsnych
• Badanie wymazów z rąk personelu i powierzchni roboczych (GHP)
• Analiza żywności w ramach postępowania epidemiologicznego (zatrucia pokarmowe)
• Weryfikacja skuteczności procesów termicznych i konserwujących

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 6888-1:2022

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania liczby gronkowców koagulazo-dodatnich (Staphylococcus aureus i inne gatunki) — Część 1: Metoda z zastosowaniem podłoża agarowego Baird-Parkera

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) — Part 1: Method using Baird-Parker agar medium

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie próbki

   Odważ 10 g (lub 25 g) próbki do woreczka stomachera. Dodaj 90 mL (lub 225 mL) wody peptonowej buforowanej. Homogenizuj 60–120 s.

   ⏱ Czas: 5 min

2. Przygotowanie rozcieńczeń

   Sporządź serię rozcieńczeń dziesiętnych (10⁻², 10⁻³). Użyj nowej pipety do każdego rozcieńczenia.

   ⏱ Czas: 5 min

3. Przygotowanie podłoża

   Rozpuść Baird-Parker Agar Base w wodzie destylowanej. Sterylizuj w 121°C przez 15 min. Schłodź do 47–50°C i dodaj aseptycznie emulsję żółtka z tellurkiem. Rozlej na płytki (ok. 18–20 mL). Wysusz płytki.

   ⏱ Czas: 30 min • 🌡 Temperatura: 47–50°C

4. Posiew powierzchniowy

   Nałóż po 0,1 mL (łącznie do 0,3 mL na 3 płytki z tego samego rozcieńczenia) na powierzchnię podłoża. Rozprowadź szpatułką Drigalskiego równomiernie po całej powierzchni.

   ⏱ Czas: 10 min

5. Suszenie inokulum

   Pozostaw płytki otwarte w komorze laminarnej do wchłonięcia inokulum (ok. 15 min).

   ⏱ Czas: 15 min

6. Inkubacja

   Odwróć płytki i inkubuj w 34–38°C. Odczytaj wstępnie po 24 ± 2 h, zaznacz typowe kolonie i kontynuuj inkubację do 48 ± 4 h.

   ⏱ Czas: 24–48 h • 🌡 Temperatura: 37°C

7. Odczyt kolonii

   Policz typowe kolonie (czarne/szare, lśniące, wypukłe, otoczone strefą przejaśnienia i/lub pierścieniem opalizacji). Zaznacz również kolonie atypowe (czarne bez stref).

   ⏱ Czas: 15 min

8. Test koagulazy (potwierdzenie)

   Wybierz min. 5 typowych i 5 atypowych kolonii. Zaszczep do 0,3 mL bulion BHI, inkubuj 24 h w 37°C. Dodaj 0,3 mL osocza króliczego. Inkubuj w 37°C i obserwuj tworzenie skrzepu po 4–6 h (max. 24 h).

   ⏱ Czas: 24 h • 🌡 Temperatura: 37°C

9. Obliczenia

   Oblicz liczbę gronkowców koagulazo-dodatnich z uwzględnieniem odsetka potwierdzonych kolonii. Wynik wyraź w jtk/g lub jtk/mL.

10. Kontrola jakości

    Kontrola pozytywna: S. aureus ATCC 25923 (kolonie typowe). Kontrola negatywna: E. coli ATCC 25922 (brak wzrostu lub kolonie nietypowe). Kontrola jałowości podłoża.

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• S. aureus — patogen BSL-2, stosować pełne środki ochrony osobistej
• Tellurek potasu — toksyczny, unikać wdychania i kontaktu ze skórą, pracować w komorze laminarnej
• Wszystkie czynności z otwartą próbką wykonywać w komorze laminarnej klasy II
• Zużyte materiały autoklawować przed utylizacją (121°C, 20 min)
• Dezynfekcja powierzchni 70% etanolem lub podchlorynem sodu 0,5%

Najczęstsze pytania