🔴 Legionella w wodzie

Mikrobiologia PN-EN ISO 11731

Przegląd

Legionella to rodzaj Gram-ujemnych pałeczek, z których najgroźniejsza dla człowieka jest Legionella pneumophila — sprawca legionellozy (choroby legionistów), ciężkiego zapalenia płuc o śmiertelności 5–30%. Bakterie Legionella bytują naturalnie w środowisku wodnym, ale stwarzają zagrożenie zdrowotne, gdy namnażają się w sztucznych systemach wodnych: instalacjach ciepłej wody użytkowej, wieżach chłodniczych, fontannach, jacuzzi, nawilżaczach i klimatyzatorach.

Zakażenie następuje drogą wziewną — przez wdychanie aerozolu wodnego zawierającego bakterie. Legionella nie przenosi się z człowieka na człowieka. Optymalna temperatura namnażania: 25–45°C, z maksimum w 35–37°C. Poniżej 20°C bakterie nie rosną, powyżej 60°C giną.

Metoda hodowlana według PN-EN ISO 11731:2017 jest jedyną metodą uznawaną przez Państwową Inspekcję Sanitarną w Polsce. Obejmuje filtrację membranową lub bezpośredni posiew, obróbkę wstępną próbki (termiczna 50°C/30 min lub kwasowa pH 2,2/5 min) w celu eliminacji flory towarzyszącej, hodowlę na podłożu GVPC (selektywnym) i BCYE (nieselektywnym) w temperaturze 36±1°C w atmosferze wilgotnej przez 7–10 dni.

Badanie jest wymagane przez Rozporządzenie Ministra Zdrowia w sprawie jakości wody w instalacjach wewnętrznych (≤100 jtk/100 mL — bez działań, >100 — czyszczenie i dezynfekcja, >1000 — natychmiastowe działania korygujące). Okres oczekiwania na wynik: 9–15 dni, co jest główną wadą metody hodowlanej.

Zasada metody

Próbkę wody zagęszcza się przez filtrację membranową (0,2 µm) lub odwirowywanie. Koncentrat poddaje się obróbce eliminującej florę towarzyszącą: termicznej (50±1°C/30 min) lub kwasowej (bufor HCl/KCl pH 2,2 przez 5 min). Próbkę wysiewa się na podłoże GVPC (agar BCYE z suplementami: glicyna, polimyksyna B, wankomycyna, cykloheksimid — hamujące bakterie i grzyby) oraz na podłoże BCYE bez suplementów (kontrola). Inkubacja: 36±1°C w atmosferze wilgotnej (>80% RH) przez 7–10 dni. Kolonie Legionella: szarawe, szkliste, o „przeciętym szkle" (cut-glass) strukturze. Potwierdzenie: brak wzrostu na BCYE bez L-cysteiny (Legionella wymaga L-cysteiny do wzrostu).

Zastosowania

• Monitoring instalacji ciepłej wody użytkowej (szpitale, hotele, budynki wielorodzinne)
• Kontrola wież chłodniczych i systemów klimatyzacyjnych
• Badanie wody w basenach, jacuzzi, SPA, fontannach
• Dochodzenie epidemiologiczne — ogniska legionellozy
• Kontrola skuteczności dezynfekcji termicznej (>70°C) i chemicznej
• Monitoring wody w obiektach opieki zdrowotnej (obowiązkowy)
• Badanie wody na zlecenie zarządców nieruchomości

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 11731:2017

Tytuł (PL)

Jakość wody — Oznaczanie ilościowe Legionella

Title (EN)

Water quality — Enumeration of Legionella

Procedura krok po kroku

1. Pobieranie próbki

   Pobierz min. 1 L wody. NIE płucz punktu poboru (bez spłukiwania). Dodaj tiosiarczan sodu (jeśli woda chlorowana). Transportuj w 5–20°C, analiza do 24 h.

   ⏱ Czas: 10 min

2. Filtracja membranowa — zagęszczenie

   Przefiltruj 1 L próbki przez sączek 0,2 µm (poliwęglanowy). Aseptycznie wytnij membranę, umieść w sterylnym pojemniku z 10 mL oszczędzonej próbki. Vortexuj energicznie 2 min.

   ⏱ Czas: 15 min

3. Obróbka termiczna

   Podziel zagęszczoną próbkę na 2 porcje. Jedną ogrzej w łaźni wodnej 50±1°C przez 30 min (eliminacja flory wrażliwej na ciepło). Drugą pozostaw bez obróbki.

   ⏱ Czas: 35 min • 🌡 Temperatura: 50 ± 1°C

4. Obróbka kwasowa (alternatywa)

   Zamiast obróbki termicznej: dodaj bufor HCl/KCl (pH 2,2) w proporcji 1:1. Kontakt 5 min. Następnie zneutralizuj buforem KOH.

   ⏱ Czas: 10 min

5. Posiew na podłoża

   Wysiij po 0,1 mL próbki (obrobionej i nieobrobionej) na płytki GVPC i BCYE. Rozsmaruj szpatułką szklaną. Wysiij w duplikacie.

   ⏱ Czas: 10 min

6. Inkubacja

   Inkubuj płytki w 36±1°C w atmosferze wilgotnej (>80% RH). Stosuj szczelnie zamknięte worki lub inkubator z tacką wodną. NIE odwracaj płytek.

   ⏱ Czas: 7–10 dni • 🌡 Temperatura: 36 ± 1°C

7. Odczyt — dzień 3 i 5

   Sprawdź płytki pod mikroskopem stereoskopowym. Jeśli flora towarzysząca zarasta płytki GVPC — wykonaj dodatkowy posiew z kolejną obróbką.

   ⏱ Czas: 15 min

8. Odczyt — dzień 7 i 10

   Policz kolonie o typowej morfologii: szarawe, szkliste, połyskujące, o strukturze „przeciętego szkła". Średnica 1–3 mm. Oznacz podejrzane kolonie.

   ⏱ Czas: 20 min

9. Potwierdzenie — subkultura

   Przenieś podejrzane kolonie na BCYE z L-cysteiną i BCYE bez L-cysteiny. Inkubuj 36°C/48 h. Wzrost na BCYE+cysteina i brak wzrostu na BCYE−cysteina = Legionella spp.

   ⏱ Czas: 48 h • 🌡 Temperatura: 36°C

10. Identyfikacja serogrup

    Potwierdzone kolonie Legionella testuj testem lateksowym (aglutynacja) do identyfikacji L. pneumophila sg 1 (najczęściej patogenna) i sg 2–14.

    ⏱ Czas: 15 min

11. Obliczenie wyniku

    Wynik = (liczba potwierdzonych kolonii × współczynnik rozcieńczenia) / objętość próbki. Podaj w jtk/100 mL lub jtk/L.

12. Kontrola jakości

    Kontrola pozytywna: L. pneumophila ATCC 33152. Kontrola negatywna: sterylna woda. Sprawdź wilgotność inkubatora i sterylność podłoży.

    ⏱ Czas: 15 min

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Legionella pneumophila — patogen BSL-2! Wszystkie prace w komorze laminarnej klasy II. Maska FFP2/FFP3 przy pracy z aerozolem
• NIE vortexować otwartych probówek z próbką — ryzyko tworzenia zakaźnego aerozolu
• Bufor kwasowy pH 2,2 — żrący, stosować rękawice i okulary ochronne
• Cykloheksimid (w GVPC) — toksyczny, mutagenny. Unikać kontaktu, pracować w wyciągu
• Materiał zakaźny — autoklaw 121°C/30 min. Płytki pakować do worków autoklawowalnych
• Próbki wody z instalacji >40°C — ryzyko oparzenia przy pobieraniu

Najczęstsze pytania