Zarejestruj się
LabCoda / Baza Wiedzy / Wykrywanie Listeria monocytogenes

🔴 Wykrywanie Listeria monocytogenes

Mikrobiologia PN-EN ISO 11290-1

Krótko: o co chodzi

Dwustopniowa metoda namnożenia selektywnego i posiewu na podłoża chromogenne do wykrywania Listeria monocytogenes w żywności. Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 11290-1:2017; Wynik: Wykryto / Nie wykryto w 25 g. Procedura obejmuje 12 kroków (łącznie około 3 dni 5 min–4 dni 2 h 5 min); stosuje się je m.in. do: Żywność gotowa do spożycia — sery miękkie, wędliny, ryby wędzone, Produkty dla niemowląt i cele medyczne specjalnego przeznaczenia, Mięso i przetwory mięsne (drób, wieprzowina).

W skrócie

  • Norma: PN-EN ISO 11290-1:2017
  • Kategoria: Mikrobiologia
  • Kroków procedury: 12
  • Łączny czas etapów: 3 dni 5 min–4 dni 2 h 5 min
  • Wynik: Wykryto / Nie wykryto w 25 g
  • Wielkość próbki: 25 g (standard)
  • Czas do wyniku: 5–7 dni roboczych

Przegląd

Listeria monocytogenes to Gram-dodatnia pałeczka będąca jednym z najgroźniejszych patogenów przenoszonych drogą pokarmową. Wywołuje listeriozę — chorobę o śmiertelności 20–30% (najwyższa wśród chorób pokarmowych). Szczególnie zagrożone są kobiety w ciąży (poronienia, zakażenie noworodków), osoby starsze i osoby z obniżoną odpornością.

L. monocytogenes jest wyjątkowo niebezpieczna, ponieważ: namnaża się w temperaturze lodówkowej (2–4°C), toleruje wysokie stężenia soli (do 10% NaCl), przeżywa w szerokim zakresie pH (4,4–9,6). Tworzy biofilmy na powierzchniach zakładów spożywczych, co utrudnia jej eliminację.

Norma PN-EN ISO 11290-1 jest metodą referencyjną wykrywania L. monocytogenes we wszystkich rodzajach żywności i pasz. Wymagana przez Rozporządzenie (WE) 2073/2005 — kryterium bezpieczeństwa: nieobecna w 25 g dla żywności gotowej do spożycia przeznaczonej dla niemowląt i celów medycznych, oraz ≤100 jtk/g w żywności gotowej do spożycia w okresie przydatności do spożycia.

Zasada metody

Metoda dwustopniowego namnożenia selektywnego:

1. **Pierwotne namnożenie (Half Fraser)** — 25 g próbki + 225 mL bulionu Half Fraser (połowa stężenia akryflawininy i kwasu nalidyksowego). Inkubacja 30°C / 24–26h. Łagodna selekcja umożliwiająca regenerację uszkodzonych komórek. 2. **Wtórne namnożenie (Fraser pełny)** — 0,1 mL → 10 mL bulionu Fraser (pełne stężenie inhibitorów). Inkubacja 37°C / 24–48h. Pociemnienie bulionu (hydroliza eskuliny → czarny osad) sugeruje obecność Listeria. 3. **Posiew na podłoża selektywne** — ALOA (chromogenne) i Oxford/PALCAM. Kolonie L. monocytogenes na ALOA: niebiesko-zielone z nieprzezroczystą strefą (fosfatydyloinozytol-specyficzna fosfolipaza C, PI-PLC). 4. **Potwierdzenie** — hemoliza na agarze z krwią, test CAMP, ruchliwość w 25°C (parasol), fermentacja cukrów (ramnoza+, ksyloza-).

Zastosowania

Kluczowe parametry

ParametrWartość
WynikWykryto / Nie wykryto w 25 g
Wielkość próbki25 g (standard)
Czas do wyniku5–7 dni roboczych
Temperatura namnożenia I30 ± 1°C (Half Fraser)
Temperatura namnożenia II37 ± 1°C (Fraser)
Granica wykrywania1 komórka / 25 g

Norma

Numer normy
PN-EN ISO 11290-1:2017
Tytuł (PL)
Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Listeria monocytogenes i Listeria spp. — Część 1: Metoda wykrywania
Title (EN)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection method

Procedura krok po kroku

  1. Przygotowanie próbki

    Odważ 25 g próbki do worka stomachera. Dodaj 225 mL bulionu Half Fraser. Homogenizuj 1–2 min.

    ⏱ Czas: 5 min

  2. Namnożenie I — Half Fraser

    Inkubuj worek z próbką w 30±1°C przez 24–26 godzin. Po inkubacji obserwuj bulion — pociemnienie sugeruje hydrolizę eskuliny (obecność Listeria spp.).

    ⏱ Czas: 24–26 h • 🌡 Temperatura: 30°C

  3. Namnożenie II — Fraser pełny

    Przenieś 0,1 mL namnożenia Half Fraser do 10 mL bulionu Fraser (pełnego). Inkubuj 37±1°C / 24 godziny (odczyt) i do 48 godzin (drugi odczyt).

    ⏱ Czas: 24–48 h • 🌡 Temperatura: 37°C

  4. Posiew z Half Fraser (24h)

    Z namnożenia Half Fraser posiej oczkiem na agar ALOA i drugie podłoże (Oxford lub PALCAM). Inkubuj 37°C / 24–48h.

    🌡 Temperatura: 37°C

  5. Posiew z Fraser (24h i 48h)

    Po 24h i po 48h bulionu Fraser posiej oczkiem na agar ALOA i drugie podłoże. Inkubuj 37°C / 24–48h.

    🌡 Temperatura: 37°C

  6. Odczyt płytek

    Na ALOA: kolonie L. monocytogenes = niebiesko-zielone z nieprzezroczystą otoczką (PI-PLC+). Na Oxford: czarne kolonie z czarną strefą (eskulina+).

  7. Izolacja czystych kultur

    Wybierz min. 5 kolonii podejrzanych. Przesiej na agar TSYEA. Inkubuj 37°C / 18–24h. Obserwuj kolonie: L. monocytogenes — drobne, szarawe, lśniące w oświetleniu Henry (niebiesko-szary blask).

    ⏱ Czas: 24 h • 🌡 Temperatura: 37°C

  8. Test hemolityczny

    Z czystej kultury posiej na agar z krwią baranią 5%. Inkubuj 37°C/24h. L. monocytogenes: wąska strefa β-hemolizy (przejrzysta otoczka wokół kolonii).

  9. Test CAMP

    Na agar z krwią posiej pionowo S. aureus i R. equi. Prostopadle posiej badany szczep. Inkubuj 37°C/18–24h. L. monocytogenes: wzmocniona hemoliza przy S. aureus, brak przy R. equi.

    🌡 Temperatura: 37°C

  10. Ruchliwość

    Zaszczep podłoże półpłynne (agar ruchliwości 0,4%). Inkubuj 25°C/48h. L. monocytogenes: wzrost "parasola" 2–5 mm pod powierzchnią (ruchliwa w 25°C, nieruchoma w 37°C).

    🌡 Temperatura: 25°C

  11. Fermentacja cukrów

    Ramnoza: DODATNIA (L. monocytogenes). Ksyloza: UJEMNA. Manitol: UJEMNA. Te 3 testy odróżniają L. monocytogenes od innych gatunków Listeria.

  12. Interpretacja i raportowanie

    Potwierdzenie = hemoliza β + CAMP+ przy S. aureus + ruchliwość parasol + ramnoza+ ksyloza- → "Listeria monocytogenes WYKRYTO w 25 g". Brak = "NIE WYKRYTO".

Wymagany sprzęt i aparatura

SprzętPrzykładOrientacyjna cena
Inkubator 30±1°CMemmert IN110, Binder BD 1155 000–15 000 PLN
Inkubator 37±1°CMemmert IN110, POL-EKO ST 25 000–15 000 PLN
StomacherSeward Stomacher 400 Circulator12 000–25 000 PLN
AutoklawTuttnauer 3870ELV, Systec VX-7530 000–80 000 PLN
Komora laminarna klasy IIESCO Airstream, Thermo MSC-Advantage25 000–60 000 PLN
Mikroskop z oświetleniem HenryOlimpus CX43, do obserwacji morfologii kolonii8 000–20 000 PLN
Pipety automatyczneEppendorf Research Plus 0,1 mL + 1 mL800–1 500 PLN/szt.

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

OdczynnikCASSzczegóły
Bulion Half Fraser—Podstawa Fraser + połowa stężenia akryflawininy (12,5 mg/L) i kw. nalidyksowego (10 mg/L). Merck 1.10398, Oxoid CM0895.
Bulion Fraser (pełny)—Pełne stężenie inhibitorów: akryflawinina 25 mg/L, kw. nalidyksowy 20 mg/L, chlorek litu 3 g/L, eskulina + amonowy cytrynian żelazawy. Merck 1.10399.
Agar ALOA (chromogenny)—Podłoże chromogenne: L. monocytogenes = niebiesko-zielone kolonie z nieprzezroczystą strefą (PI-PLC+). Inne Listeria = niebiesko-zielone BEZ strefy. Merck 1.00427, bioMérieux.
Agar Oxford—Z suplementem (cykloheksymidem, kolistyną, akryflawiną, cefotetanem, fosforanami). Kolonie: czarne z czarną strefą (eskulina). Oxoid CM0856.
Agar TSYEA—Tryptic Soy Yeast Extract Agar — do izolacji czystych kultur. TSA + 0,6% ekstrakt drożdżowy.
Agar z krwią baranią 5%—Do testu hemolitycznego — L. monocytogenes daje wąską strefę β-hemolizy.
Szczep Staphylococcus aureus ATCC 25923—Do testu CAMP — wzmocnienie hemolizy w strefie S. aureus.
Szczep Rhodococcus equi ATCC 6939—Do testu CAMP — brak wzmocnienia (odróżnienie od L. ivanovii).

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

Najczęstsze pytania

Jaka norma opisuje to badanie?

Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 11290-1:2017 — „Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania i oznaczania liczby Listeria monocytogenes i Listeria spp. — Część 1: Metoda wykrywania”. Tytuł angielski: „Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes and of Listeria spp. — Part 1: Detection method”.

Na czym polega ta metoda?

Metoda dwustopniowego namnożenia selektywnego: 1. **Pierwotne namnożenie (Half Fraser)** — 25 g próbki + 225 mL bulionu Half Fraser (połowa stężenia akryflawininy i kwasu nalidyksowego).

Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?

Wynik: Wykryto / Nie wykryto w 25 g; Wielkość próbki: 25 g (standard); Czas do wyniku: 5–7 dni roboczych; Temperatura namnożenia I: 30 ± 1°C (Half Fraser).

Ile trwa wykonanie badania?

Suma czasów podanych przy poszczególnych etapach to około 3 dni 5 min–4 dni 2 h 5 min. Procedura obejmuje 12 kroków.

Jaki sprzęt jest potrzebny?

Inkubator 30±1°C, Inkubator 37±1°C, Stomacher, Autoklaw, Komora laminarna klasy II, Mikroskop z oświetleniem Henry, Pipety automatyczne. Orientacyjny koszt podstawowej aparatury (Inkubator 30±1°C): 5 000–15 000 PLN.

Gdzie stosuje się to badanie?

Żywność gotowa do spożycia — sery miękkie, wędliny, ryby wędzone; Produkty dla niemowląt i cele medyczne specjalnego przeznaczenia; Mięso i przetwory mięsne (drób, wieprzowina); Produkty rybne — surowe i wędzone (łosoś, makrela); Produkty mleczne — sery, lody, mleko pasteryzowane; Warzywa i owoce gotowe do spożycia (sałatki, smoothie); Monitoring środowiskowy zakładów (wymazy z powierzchni, drenów, chłodni).

Jakie środki ostrożności obowiązują?

Listeria monocytogenes — patogen BSL-2! Praca wyłącznie w komorze laminarnej; Szczególnie niebezpieczna dla kobiet w ciąży — zakaz pracy z L. monocytogenes dla pracownic w ciąży; Rękawice nitrylowe, fartuch, okulary ochronne obowiązkowe; Wszystkie odpady autoklawitować (121°C/20 min) przed utylizacją; Dezynfekcja stanowiska po pracy: 70% etanol + 0,5% roztwór podchlorynu sodu; Krew barania — źródło potencjalnych alergenów, postępować ostrożnie.

Które laboratorium wykona to badanie?

Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN ISO 11290-1.

🔍 Znajdź laboratorium wykonujące to badanie