🍄 Mikotoksyny — aflatoksyny, ochratoksyna A

Chemia żywności PN-EN 14123 / PN-EN 15851

Przegląd

Mikotoksyny to toksyczne metabolity wtórne pleśni (Aspergillus, Penicillium, Fusarium) stanowiące poważne zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt. Aflatoksyna B1 jest najsilniejszym znanym naturalnym kancerogenem (Grupa 1 IARC), a ochratoksyna A jest nefrotoksyczna i prawdopodobnie rakotwórcza (Grupa 2B). Przepisy UE (Rozp. WE 1881/2006, Rozp. UE 2023/915) ustanawiają rygorystyczne limity w żywności: aflatoksyna B1 2–12 µg/kg, suma aflatoksyn 4–15 µg/kg, ochratoksyna A 3–10 µg/kg.

Metoda analityczna oparta na normach EN 14123 (aflatoksyny) i EN 15851 (ochratoksyna A) polega na ekstrakcji próbki mieszaniną acetonitryl/woda (lub metanol/woda), oczyszczaniu na kolumnach immunopowinowactwa (IAC) i oznaczeniu HPLC z detekcją fluorescencyjną (FLD). Kolumny IAC zawierają przeciwciała monoklonalne specyficznie wiążące mikotoksyny docelowe, co zapewnia wysoką selektywność oczyszczania.

Aflatoksyny B1 i G1 wymagają derywatyzacji pofluorescencyjnej (bromowanie jodem lub kobaltem, fotochemiczna UV lub elektrochemiczna KOBRA Cell) w celu wzmocnienia sygnału fluorescencji. Aflatoksyny B2 i G2 fluoryzują natywnie. Ochratoksyna A ma silną natywną fluorescencję i nie wymaga derywatyzacji.

Alternatywnie stosuje się detekcję LC-MS/MS (bez derywatyzacji), co pozwala na jednoczesne oznaczanie wielu mikotoksyn (aflatoksyny, ochratoksyna, deoksyniwalenol, zearalenon, fumonizyny, T-2/HT-2) w jednym badaniu (metoda multi-mikotoksynowa). Kolumny VICAM Myco6in1+ lub R-Biopharm EASI-EXTRACT umożliwiają oczyszczanie wielu mikotoksyn jednocześnie.

Zasada metody

Ekstrakcja: Próbka (25–50 g) jest ekstrahowana mieszaniną acetonitryl/woda (80:20 v/v) lub metanol/woda (80:20) z NaCl. Oczyszczanie IAC: Rozcieńczony ekstrakt jest przepuszczany przez kolumnę immunopowinowactwa (np. VICAM AflaOchra, R-Biopharm EASI-EXTRACT). Mikotoksyny wiążą się selektywnie z przeciwciałami na kolumnie, a zanieczyszczenia matrycowe są odmywane wodą. Mikotoksyny są eluowane metanolem (1–3 mL). Detekcja HPLC-FLD: Eluat jest nastrzykiwany na kolumnę C18. Aflatoksyny są derywatyzowane (KOBRA Cell — bromowanie elektrochemiczne). Detekcja fluorescencyjna: λex 365 nm / λem 435 nm (aflatoksyny), λex 333 nm / λem 460 nm (ochratoksyna A). Kwantyfikacja z krzywych kalibracyjnych.

Zastosowania

• Urzędowa kontrola aflatoksyn w orzechach, zbożach, przyprawach (Rozp. UE 2023/915)
• Oznaczanie ochratoksyny A w zbożach, kawie, winie, kakao
• Kontrola pasz i surowców paszowych (aflatoksyna B1)
• Badanie żywności dla niemowląt (najniższe limity: 0,10 µg/kg)
• Monitoring mleka — aflatoksyna M1 (limit 0,050 µg/kg)
• Kontrola suszonych owoców (figi, rodzynki, morele)
• Certyfikacja BRC/IFS importowanych surowców

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN 14123:2008 / PN-EN 15851:2010

Tytuł (PL)

Żywność — Oznaczanie aflatoksyn B1, B2, G1, G2 i ochratoksyny A z zastosowaniem kolumnek immunopowinowactwa i HPLC

Title (EN)

Foodstuffs — Determination of aflatoxins B1, B2, G1, G2 and ochratoxin A using immunoaffinity column clean-up and HPLC

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie próbki

   Zmiel/zhomogenizuj próbkę (min. 100 g). Odważ 25 g do kolby stożkowej.

   ⏱ Czas: 10 min

2. Ekstrakcja

   Dodaj 5 g NaCl i 100 mL acetonitrylu/wody (80:20). Wytrząsaj intensywnie 30 min (wytrząsarka orbitalna).

   ⏱ Czas: 30 min

3. Filtracja i rozcieńczenie

   Przesącz przez sączek fałdowany. Pobierz alikwot (np. 10 mL) i rozcieńcz PBS do 50 mL (obniżenie stężenia MeCN < 25%).

   ⏱ Czas: 10 min

4. Oczyszczanie IAC

   Przepuść rozcieńczony ekstrakt przez kolumnę IAC (przepływ 1–2 krople/s). Mikotoksyny wiążą się z przeciwciałami.

   ⏱ Czas: 10–15 min

5. Przemywanie

   Przemyj kolumnę 20 mL wody dejonizowanej (usunięcie zanieczyszczeń matrycowych). Odsysaj powietrze 30 s.

   ⏱ Czas: 5 min

6. Elucja

   Eluuj mikotoksyny 1,5 mL metanolu (przepływ 1 kropla/2 s). Zbierz do fiolki HPLC. Odparuj do sucha pod N₂ i odtwórz w fazie ruchomej.

   ⏱ Czas: 10 min

7. Nastrzyknięcie HPLC

   Nastrzyknij 50–100 µL na kolumnę C18. Faza ruchoma: H₂O/MeCN/MeOH z kwasem octowym. Gradient lub izokratycznie.

   ⏱ Czas: 20–30 min

8. Detekcja FLD

   Detekcja fluorescencyjna z celą KOBRA: aflatoksyny λex 365 / λem 435 nm, ochratoksyna A λex 333 / λem 460 nm.

   ⏱ Czas: w trakcie HPLC

9. Kwantyfikacja

   Oblicz stężenia z krzywych kalibracyjnych (5–7 punktów). Uwzględnij współczynnik rozcieńczenia i masę próbki.

   ⏱ Czas: 15 min

10. Kontrola jakości

    Co serię: ślepa, próbka fortyfikowana, CRM (FAPAS/BIPEA). Odzysk aflatoksyn 70–110%, ochratoksyny 70–110%. Uczestnictwo w PT.

    ⏱ Czas: 60 min

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• Aflatoksyny — silnie rakotwórcze (Grupa 1 IARC). Stosować rękawice podwójne, pracować w wydzielonym obszarze.
• Wzorce mikotoksyn — toksyczne. Przechowywać w zamrażarce (-20°C). Roztwory sporządzać pod dygestorium.
• Acetonitryl — łatwopalny i toksyczny (H225, H302, H312, H332). Pracować pod wyciągiem.
• Metanol — łatwopalny i toksyczny (H225, H301, H311, H331). Toksyczny przy wdychaniu i połknięciu.
• Dekontaminacja aflatoksyn — roztwór podchlorynu sodu (NaOCl 5%) neutralizuje aflatoksyny na powierzchniach.
• Odpady zawierające mikotoksyny — zbierać oddzielnie i neutralizować chemicznie przed utylizacją.

Najczęstsze pytania