🧫 Ogólna liczba mikroorganizmów 36°C
Krótko: o co chodzi
Oznaczanie ogólnej liczby kolonii mikroorganizmów zdolnych do wzrostu w 36±2°C po 44±4 h metodą posiewu wgłębnego w agarze z ekstraktem drożdżowym. Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 6222:2004; Wynik: jtk/1 mL (jednostki tworzące kolonie). Procedura obejmuje 10 kroków (łącznie około 5 h 20 min); stosuje się je m.in. do: Kontrola jakości wody pitnej (parametr wskaźnikowy wg Rozporządzenia MZ), Ocena ryzyka sanitarnego — wykrywanie bakterii mezofilnych, Monitoring efektywności dezynfekcji wody (chlorowanie, UV).
W skrócie
- Norma: PN-EN ISO 6222:2004
- Kategoria: Mikrobiologia
- Kroków procedury: 10
- Łączny czas etapów: 5 h 20 min
- Wynik: jtk/1 mL (jednostki tworzące kolonie)
- Kryterium (woda pitna): Brak nieprawidłowych zmian (praktycznie: <20 jtk/mL)
- Temperatura inkubacji: 36 ± 2°C
Przegląd
Ogólna liczba mikroorganizmów w 36°C (HPC 36 — Heterotrophic Plate Count w 36°C) jest komplementarnym parametrem do oznaczania w 22°C i dostarcza odmiennej informacji diagnostycznej. Mikroorganizmy rosnące w temperaturze 36±2°C (zbliżonej do temperatury ciała) to organizmy potencjalnie pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, które lepiej adaptują się do warunków ciepłokrwistego żywiciela. Ich obecność w wodzie pitnej ma większe znaczenie sanitarne niż mikroorganizmów w 22°C.
Podwyższona liczba kolonii w 36°C w porównaniu do 22°C może wskazywać na świeże zanieczyszczenie wody materiałem biologicznym pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, nieskuteczną dezynfekcję lub kontaminację sieci wodociągowej. Wynik interpretuje się łącznie z oznaczeniem w 22°C — stosunek OLM 36°C / OLM 22°C dostarcza cennych informacji o charakterze zanieczyszczenia.
Procedura analityczna jest identyczna jak w oznaczeniu w 22°C — metoda posiewu wgłębnego (pour plate) na agarze YEA — z tą różnicą, że inkubacja prowadzona jest w temperaturze 36±2°C przez 44±4 godziny (ok. 2 doby). Krótszy czas inkubacji wynika z szybszego wzrostu bakterii mezofilnych w optymalnej dla nich temperaturze.
Parametr jest obligatoryjny w badaniach wody pitnej wg Rozporządzenia MZ. Wartość normatywna: „brak nieprawidłowych zmian". W praktyce laboratoryjnej wartość referencyjna: <20 jtk/mL w wodzie uzdatnionej, do 100 jtk/mL w sieci.
Zasada metody
Identyczna zasada jak w oznaczaniu przy 22°C (posiew wgłębny, pour plate): 1 mL próbki wody odmierza się do sterylnej szalki Petriego, zalewa 15–20 mL rozstopionego i schłodzonego do 44–47°C agaru z ekstraktem drożdżowym (YEA). Po zestaleniu inkubuje się w 36±2°C przez 44±4 h. Temperatura 36°C jest zbliżona do temperatury ciała człowieka, co faworyzuje wzrost bakterii mezofilnych — potencjalnie patogennych lub wskaźnikowych. Kolonie zlicza się na powierzchni i wewnątrz agaru.
Zastosowania
- Kontrola jakości wody pitnej (parametr wskaźnikowy wg Rozporządzenia MZ)
- Ocena ryzyka sanitarnego — wykrywanie bakterii mezofilnych
- Monitoring efektywności dezynfekcji wody (chlorowanie, UV)
- Kontrola wody butelkowanej — zmiany w czasie przechowywania
- Badanie wody w szpitalach i placówkach opieki zdrowotnej
- Monitoring wody basenowej
- Porównanie ze stosunkiem OLM 36°C / OLM 22°C — diagnostyka źródła zanieczyszczenia
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Wynik | jtk/1 mL (jednostki tworzące kolonie) |
| Kryterium (woda pitna) | Brak nieprawidłowych zmian (praktycznie: <20 jtk/mL) |
| Temperatura inkubacji | 36 ± 2°C |
| Czas inkubacji | 44 ± 4 godziny (ok. 2 doby) |
| Objętość próbki | 1 mL (posiew wgłębny) |
| Podłoże | Agar z ekstraktem drożdżowym (YEA) |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 6222:2004
- Tytuł (PL)
- Jakość wody — Oznaczanie ilościowe mikroorganizmów zdolnych do wzrostu — Oznaczanie ogólnej liczby kolonii metodą posiewu w agarze odżywczym
- Title (EN)
- Water quality — Enumeration of culturable micro-organisms — Colony count by inoculation in a nutrient agar culture medium
Procedura krok po kroku
-
Przygotowanie podłoża YEA
Rozpuść agar YEA zgodnie z instrukcją producenta. Wysterylizuj w autoklawie 121°C/15 min. Utrzymuj w łaźni wodnej 44–47°C (max 4 godziny).
-
Przygotowanie próbki
Wymieszaj próbkę delikatnie (25 odwróceń butelki). Neutralizuj chlor tiosiarczanem sodu, jeśli obecny.
-
Posiew wgłębny (pour plate)
Odmierz pipetą 1 mL próbki do sterylnej szalki Petriego (duplikat). Dla próbek o podejrzeniu wysokiego zanieczyszczenia: przygotuj rozcieńczenia 10⁻¹, 10⁻².
-
Zalewanie agarem YEA
Natychmiast zalej 15–20 mL rozstopionego YEA (44–47°C). Wymieszaj delikatnym ruchem obrotowym (ruch ósemki). Nie wytwarzaj pęcherzyków.
-
Zestalanie
Pozostaw szalki na płaskiej powierzchni do zestalenia (15–20 min). Nie przenoś szalek przed zestaleniem.
-
Inkubacja 36°C
Umieść szalki odwrócone w inkubatorze 36±2°C. Inkubuj przez 44±4 godziny (ok. 2 doby).
-
Odczyt wyników
Policz wszystkie kolonie (powierzchniowe i wgłębne) za pomocą lupy lub licznika automatycznego. Optymalny zakres: 15–300 kolonii na szalkę.
-
Obliczenie wyniku
Wynik = średnia z duplikatów × współczynnik rozcieńczenia. Podaj w jtk/1 mL. Zaokrąglij do 2 cyfr znaczących. Np. 127 → 130 jtk/mL.
-
Interpretacja diagnostyczna
Porównaj wynik z OLM w 22°C. Stosunek OLM 36°C / OLM 22°C > 1 sugeruje świeże zanieczyszczenie z zewnątrz. OLM 36°C / OLM 22°C < 1 — typowe dla namnażania naturalnej flory wodnej.
-
Kontrola jakości i utylizacja
Kontrola negatywna: szalka z samym agarem. Kontrola temperatury: rejestrator w inkubatorze. Autoklawuj szalki po odczycie 121°C/30 min.
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Inkubator 36°C | Binder BD 56, Memmert IN30, Pol-Eko CLN 32 | 5 000–15 000 PLN |
| Łaźnia wodna 44–47°C | Memmert WNB 7, Julabo TW2 | 3 000–8 000 PLN |
| Autoklaw | Tuttnauer ELV 2540, Systec VX-40 | 20 000–45 000 PLN |
| Pipety automatyczne 1 mL | Eppendorf Research Plus 100–1000 µL, Gilson Pipetman L | 800–2 500 PLN/szt. |
| Szalki Petriego sterylne 90 mm | Polistyrenowe, jednorazowe, sterylne. Citotest, Gosselin | 150–300 PLN/opak. (500 szt.) |
| Lupa / licznik kolonii | Stuart SC6+, Interscience Scan 500 | 1 500–25 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Agar z ekstraktem drożdżowym (YEA) | — | Yeast Extract Agar: pepton 5 g/L, ekstrakt drożdżowy 2,5 g/L, glukoza 1 g/L, agar 9–18 g/L. Producenci: Merck, Oxoid, Biokar |
| Tiosiarczan sodu (Na₂S₂O₃) | 7772-98-7 | Do neutralizacji chloru w próbkach wody sieciowej, buforki 1,8% |
| Woda peptonowa buforowana | — | Do rozcieńczania próbek, sterylne buforki po 9 mL, 0,1% pepton + 0,85% NaCl |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Próbki wody mogą zawierać patogeny mezofilne — rękawice nitrylowe, fartuch, okulary ochronne
- Roztopiony agar (44–47°C) — ryzyko oparzenia przy zalewaniu szalek
- Kolonie mezofilne mogą zawierać patogeny oportunistyczne — autoklaw przed utylizacją
- Ostrożność przy pracy z palnikiem Bunsena — ogień otwarty w laboratorium
Najczęstsze pytania
Jaka norma opisuje to badanie?
Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 6222:2004 — „Jakość wody — Oznaczanie ilościowe mikroorganizmów zdolnych do wzrostu — Oznaczanie ogólnej liczby kolonii metodą posiewu w agarze odżywczym”. Tytuł angielski: „Water quality — Enumeration of culturable micro-organisms — Colony count by inoculation in a nutrient agar culture medium”.
Na czym polega ta metoda?
Identyczna zasada jak w oznaczaniu przy 22°C (posiew wgłębny, pour plate): 1 mL próbki wody odmierza się do sterylnej szalki Petriego, zalewa 15–20 mL rozstopionego i schłodzonego do 44–47°C agaru z ekstraktem drożdżowym (YEA). Po zestaleniu inkubuje się w 36±2°C przez 44±4 h.
Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?
Wynik: jtk/1 mL (jednostki tworzące kolonie); Kryterium (woda pitna): Brak nieprawidłowych zmian (praktycznie: <20 jtk/mL); Temperatura inkubacji: 36 ± 2°C; Czas inkubacji: 44 ± 4 godziny (ok. 2 doby).
Ile trwa wykonanie badania?
Suma czasów podanych przy poszczególnych etapach to około 5 h 20 min. Procedura obejmuje 10 kroków.
Jaki sprzęt jest potrzebny?
Inkubator 36°C, Łaźnia wodna 44–47°C, Autoklaw, Pipety automatyczne 1 mL, Szalki Petriego sterylne 90 mm, Lupa / licznik kolonii. Orientacyjny koszt podstawowej aparatury (Inkubator 36°C): 5 000–15 000 PLN.
Gdzie stosuje się to badanie?
Kontrola jakości wody pitnej (parametr wskaźnikowy wg Rozporządzenia MZ); Ocena ryzyka sanitarnego — wykrywanie bakterii mezofilnych; Monitoring efektywności dezynfekcji wody (chlorowanie, UV); Kontrola wody butelkowanej — zmiany w czasie przechowywania; Badanie wody w szpitalach i placówkach opieki zdrowotnej; Monitoring wody basenowej; Porównanie ze stosunkiem OLM 36°C / OLM 22°C — diagnostyka źródła zanieczyszczenia.
Jakie środki ostrożności obowiązują?
Próbki wody mogą zawierać patogeny mezofilne — rękawice nitrylowe, fartuch, okulary ochronne; Roztopiony agar (44–47°C) — ryzyko oparzenia przy zalewaniu szalek; Kolonie mezofilne mogą zawierać patogeny oportunistyczne — autoklaw przed utylizacją; Ostrożność przy pracy z palnikiem Bunsena — ogień otwarty w laboratorium.
Które laboratorium wykona to badanie?
Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN ISO 6222.