Zarejestruj się
LabCoda / Baza Wiedzy / Pseudomonas aeruginosa w wodzie

🧫 Pseudomonas aeruginosa w wodzie

Mikrobiologia PN-EN ISO 16266

Krótko: o co chodzi

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Pseudomonas aeruginosa w wodzie metodą filtracji membranowej na podłożu CN (cetrimide-nalidixic acid). Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 16266:2009; Wynik: jtk/250 mL (woda butelkowana) lub jtk/100 mL. Procedura obejmuje 10 kroków (łącznie około 3 dni 16 h 52 min–4 dni 52 min); stosuje się je m.in. do: Badanie wody butelkowanej i źródlanej (parametr obligatoryjny), Monitoring wody w basenach kąpielowych i aquaparkach, Kontrola wody w szpitalach i obiektach opieki zdrowotnej.

W skrócie

  • Norma: PN-EN ISO 16266:2009
  • Kategoria: Mikrobiologia
  • Kroków procedury: 10
  • Łączny czas etapów: 3 dni 16 h 52 min–4 dni 52 min
  • Wynik: jtk/250 mL (woda butelkowana) lub jtk/100 mL
  • Dopuszczalna wartość: 0 jtk/250 mL (woda butelkowana)
  • Temperatura inkubacji: 36 ± 2°C

Przegląd

Pseudomonas aeruginosa jest Gram-ujemną, tlenową pałeczką, jednym z najważniejszych patogenów oportunistycznych środowiska wodnego. Bakteria ta potrafi namnażać się w wodzie o bardzo niskiej zawartości substancji odżywczych, tworzy biofilmy na powierzchniach instalacji wodnych, jest odporna na wiele środków dezynfekcyjnych i antybiotyków. Może powodować zakażenia ran, ucha zewnętrznego (zapalenie ucha pływaków), układu moczowego oraz poważne zakażenia szpitalne u pacjentów immunosupresyjnych.

P. aeruginosa nie jest typowym wskaźnikiem zanieczyszczenia kałowego — bakteria pochodzi głównie ze środowiska (gleba, roślinność, biofilmy w instalacjach). Jej obecność w wodzie butelkowanej lub basenowej wskazuje na problemy higieniczne w procesie produkcji, magazynowania lub dystrybucji. Jest parametrem obligatoryjnym dla wody butelkowanej, wody w basenach kąpielowych i wody w obiektach opieki zdrowotnej.

Metoda według PN-EN ISO 16266 wykorzystuje filtrację membranową i hodowlę na podłożu selektywnym z cetrimidem (bromek cetylotrimetyloamoniowy — kationowy detergent hamujący wzrost większości bakterii poza Pseudomonas) i kwasem nalidyksowym (inhibitor bakterii Gram-ujemnych wrażliwych na chinolony). Kolonie P. aeruginosa produkują charakterystyczne pigmenty: piocyjaninę (niebieskozielony) lub fluoresceinę (żółtozielony fluorescencyjny).

Potwierdzenie obejmuje test produkcji amoniaku z acetamidu (odczynnik Nesslera) — pozytywny dla P. aeruginosa — oraz opcjonalnie wzrost w 42°C i test oksydazowy.

Zasada metody

Próbkę wody filtruje się przez membranę 0,45 µm i umieszcza na podłożu CN (Pseudomonas CN agar) zawierającym cetrimid (0,2 g/L) i kwas nalidyksowy (15 mg/L). Inkubacja w 36±2°C przez 40–48 h. Cetrimid hamuje większość bakterii poza Pseudomonas spp. — działa jako kationowy detergent uszkadzający błony komórkowe. P. aeruginosa produkuje rozpuszczalne pigmenty: piocyjaninę (niebiesko-zielona, widoczna w świetle dziennym) i/lub fluoresceinę (żółto-zielona, fluoryzująca w UV 365 nm). Kolonie produkujące piocyjaninę nie wymagają potwierdzenia. Kolonie fluorescencyjne lub brązowo-czerwone wymagają testu acetamidowego.

Zastosowania

Kluczowe parametry

ParametrWartość
Wynikjtk/250 mL (woda butelkowana) lub jtk/100 mL
Dopuszczalna wartość0 jtk/250 mL (woda butelkowana)
Temperatura inkubacji36 ± 2°C
Czas inkubacji40–48 godzin
Lampa UV365 nm do obserwacji fluorescencji
Objętość próbki250 mL (woda butelkowana), 100 mL (inne)

Norma

Numer normy
PN-EN ISO 16266:2009
Tytuł (PL)
Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Pseudomonas aeruginosa — Metoda filtracji membranowej
Title (EN)
Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Method by membrane filtration

Procedura krok po kroku

  1. Przygotowanie stanowiska

    Wysterylizuj zestaw filtracyjny. Przygotuj płytki Pseudomonas CN Agar (wyjmij z lodówki 30 min wcześniej).

    ⏱ Czas: 20 min

  2. Filtracja membranowa

    Przefiltruj 250 mL próbki (woda butelkowana) lub 100 mL (inne wody) przez sączek 0,45 µm. Przepłucz lejek sterylną wodą peptonową.

    ⏱ Czas: 5 min

  3. Przeniesienie na podłoże

    Sterylną pęsetą przenieś sączek na powierzchnię Pseudomonas CN Agar. Unikaj pęcherzyków powietrza.

    ⏱ Czas: 2 min

  4. Inkubacja

    Inkubuj płytki odwrócone w 36±2°C przez 40–48 godzin. Po 24 h możliwa wstępna ocena.

    ⏱ Czas: 40–48 h • 🌡 Temperatura: 36 ± 2°C

  5. Odczyt — produkcja piocyjaniny

    Sprawdź kolonie w świetle dziennym. Kolonie niebiesko-zielone (piocyjanina) = potwierdzone P. aeruginosa bez dalszych testów.

    ⏱ Czas: 5 min

  6. Odczyt — fluorescencja UV

    Obejrzyj płytki pod lampą UV 365 nm. Kolonie fluoryzujące żółto-zielono ale bez piocyjaniny → wymagają potwierdzenia.

    ⏱ Czas: 5 min

  7. Test potwierdzający — acetamid

    Przenieś kolonie wymagające potwierdzenia do probówek z podłożem acetamidowym. Inkubuj 36°C/24 h. Dodaj odczynnik Nesslera — żółte zabarwienie = NH₃ = P. aeruginosa (+).

    ⏱ Czas: 24 h • 🌡 Temperatura: 36°C

  8. Test wzrostu w 42°C (opcjonalnie)

    Przenieś kolonie na agar odżywczy i inkubuj w 42°C/24 h. Wzrost potwierdza P. aeruginosa (inne Pseudomonas nie rosną w 42°C).

    ⏱ Czas: 24 h • 🌡 Temperatura: 42°C

  9. Obliczenie wyniku

    Wynik = liczba potwierdzonych kolonii / objętość próbki. Podaj w jtk/250 mL (woda butelkowana) lub jtk/100 mL.

  10. Kontrola jakości

    Kontrola pozytywna: P. aeruginosa ATCC 27853. Kontrola negatywna: sterylna woda. Kontrola selektywności: E. coli ATCC 25922 (brak wzrostu).

    ⏱ Czas: 15 min

Wymagany sprzęt i aparatura

SprzętPrzykładOrientacyjna cena
System filtracji membranowejSartorius Combisart, Merck EZ-Fit3 000–12 000 PLN
Pompa próżniowaKNF Laboport N 8103 000–8 000 PLN
Inkubator 36°CBinder BD 56, Memmert IN305 000–15 000 PLN
Lampa UV 365 nm (Wood)Vilber Lourmat VL-6.L, Analytik Jena UVhand500–3 000 PLN
AutoklawTuttnauer ELV 254020 000–45 000 PLN
Inkubator 42°C (potwierdzenie)Binder BD 235 000–15 000 PLN
Komora laminarnaEsco Airstream15 000–40 000 PLN

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

OdczynnikCASSzczegóły
Pseudomonas CN Agar—Podłoże selektywne z cetrimidem i kwasem nalidyksowym + glicerol. Producenci: Oxoid, Merck, Biokar
Cetrimid (bromek cetylotrimetyloamoniowy)57-09-0Kationowy detergent, selektywny inhibitor, stężenie 0,2 g/L w podłożu
Kwas nalidyksowy389-08-2Inhibitor bakterii Gram-ujemnych wrażliwych, stężenie 15 mg/L w podłożu
Odczynnik Nesslera (K₂HgI₄)7783-33-7Do wykrywania amoniaku z acetamidu — żółte/brązowe zabarwienie = wynik dodatni. UWAGA: zawiera rtęć!
Acetamid (CH₃CONH₂)60-35-5Podłoże do testu potwierdzającego — P. aeruginosa deaminuje acetamid do amoniaku
Sączki membranowe 0,45 µm—MCE, 47 mm, sterylne. Merck Millipore, Sartorius
Tiosiarczan sodu (Na₂S₂O₃)7772-98-7Neutralizacja chloru w próbkach

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

Najczęstsze pytania

Jaka norma opisuje to badanie?

Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 16266:2009 — „Jakość wody — Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Pseudomonas aeruginosa — Metoda filtracji membranowej”. Tytuł angielski: „Water quality — Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa — Method by membrane filtration”.

Na czym polega ta metoda?

Próbkę wody filtruje się przez membranę 0,45 µm i umieszcza na podłożu CN (Pseudomonas CN agar) zawierającym cetrimid (0,2 g/L) i kwas nalidyksowy (15 mg/L). Inkubacja w 36±2°C przez 40–48 h.

Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?

Wynik: jtk/250 mL (woda butelkowana) lub jtk/100 mL; Dopuszczalna wartość: 0 jtk/250 mL (woda butelkowana); Temperatura inkubacji: 36 ± 2°C; Czas inkubacji: 40–48 godzin.

Ile trwa wykonanie badania?

Suma czasów podanych przy poszczególnych etapach to około 3 dni 16 h 52 min–4 dni 52 min. Procedura obejmuje 10 kroków.

Jaki sprzęt jest potrzebny?

System filtracji membranowej, Pompa próżniowa, Inkubator 36°C, Lampa UV 365 nm (Wood), Autoklaw, Inkubator 42°C (potwierdzenie), Komora laminarna. Orientacyjny koszt podstawowej aparatury (System filtracji membranowej): 3 000–12 000 PLN.

Gdzie stosuje się to badanie?

Badanie wody butelkowanej i źródlanej (parametr obligatoryjny); Monitoring wody w basenach kąpielowych i aquaparkach; Kontrola wody w szpitalach i obiektach opieki zdrowotnej; Badanie wody pitnej w budynkach użyteczności publicznej; Ocena jakości wody w instalacjach chłodniczych (wieże chłodnicze); Kontrola biofilmów w systemach dystrybucji wody; Badanie wody do dializ i celów farmaceutycznych.

Jakie środki ostrożności obowiązują?

P. aeruginosa — patogen oportunistyczny, BSL-2. Rękawice, fartuch, okulary ochronne. Pracować w komorze laminarnej; Odczynnik Nesslera — zawiera rtęć (Hg), silnie toksyczny! Stosować wyłącznie pod wyciągiem, rękawice nitrylowe, utylizacja jako odpad niebezpieczny; Cetrimid — drażniący dla skóry i oczu. Stosować rękawice ochronne; Kwas nalidyksowy — unikać kontaktu ze skórą, możliwe reakcje alergiczne; Materiał zakaźny — autoklaw 121°C/30 min przed utylizacją.

Które laboratorium wykona to badanie?

Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN ISO 16266.

🔍 Znajdź laboratorium wykonujące to badanie