🦠 Wykrywanie Salmonella spp.
Krótko: o co chodzi
Klasyczna metoda hodowlana wykrywania Salmonelli w żywności i paszach. Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 6579-1:2017; Wynik: Wykryto / Nie wykryto w 25 g (obecność/brak). Procedura obejmuje 12 kroków (łącznie około 4 dni 18 h 7 min); stosuje się je m.in. do: Kontrola żywności gotowej do spożycia (Rozp. 2073/2005), Badanie mięsa drobiowego, wieprzowego, wołowego, Kontrola jaj i produktów jajecznych.
W skrócie
- Norma: PN-EN ISO 6579-1:2017
- Kategoria: Mikrobiologia
- Kroków procedury: 12
- Łączny czas etapów: 4 dni 18 h 7 min
- Wynik: Wykryto / Nie wykryto w 25 g (obecność/brak)
- Wielkość próbki: 25 g (lub inny określony w normie)
- Czas do wyniku: 4–5 dni roboczych
Przegląd
Salmonella to rodzaj Gram-ujemnych pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, będących jednym z najważniejszych patogenów przenoszonych drogą pokarmową na świecie. Powoduje salmonellozę — chorobę objawiającą się biegunką, gorączką, bólami brzucha. Najczęstsze gatunki: S. Enteritidis (jaja, drób) i S. Typhimurium (mięso, warzywa).
Norma PN-EN ISO 6579-1 jest „złotym standardem" wykrywania Salmonelli w żywności, paszach, próbkach środowiskowych z zakładów produkcji żywności. Metoda jest horyzontalna — stosowana do wszystkich rodzajów żywności i pasz. Jest wymagana przez Rozporządzenie (WE) 2073/2005 (kryteria mikrobiologiczne) i krajowe programy monitoringowe.
Kryterium: Salmonella — nieobecna w 25 g (BRAK/ABSENT) dla większości produktów gotowych do spożycia, mięsa, jaj, produktów dla niemowląt. Wykrycie Salmonelli w żywności skutkuje wycofaniem partii z rynku.
Zasada metody
Metoda czterostopniowa oparta na hodowli klasycznej:
1. **Wstępne namnożenie (pre-enrichment)** — próbka w zbuforowanej wodzie peptonowej (BPW), 18h/37°C. Resuscytacja uszkodzonych komórek. 2. **Selektywne namnożenie (selective enrichment)** — posiew na RVS (Rappaport-Vassiliadis) 41,5°C/24h oraz MKTTn (Müller-Kauffmann z tetrathionianem) 37°C/24h. Selektywna inhibicja flory towarzyszącej. 3. **Posiew na podłoża selektywno-różnicujące** — XLD agar + drugie podłoże (BGA, chromogenne). Kolonie typowe: czarne centrum na XLD (produkcja H₂S). 4. **Potwierdzenie biochemiczne i serologiczne** — TSI, LDC, mocznik, indol, VP, aglutynacja z surowicami.
Zastosowania
- Kontrola żywności gotowej do spożycia (Rozp. 2073/2005)
- Badanie mięsa drobiowego, wieprzowego, wołowego
- Kontrola jaj i produktów jajecznych
- Badanie warzyw, owoców, kiełków
- Monitoring środowiskowy zakładów spożywczych (wymazy)
- Badanie pasz i surowców paszowych
- Woda i środowisko (adaptacja metody)
Kluczowe parametry
| Parametr | Wartość |
|---|---|
| Wynik | Wykryto / Nie wykryto w 25 g (obecność/brak) |
| Wielkość próbki | 25 g (lub inny określony w normie) |
| Czas do wyniku | 4–5 dni roboczych |
| Granica wykrywania | 1 komórka / 25 g (teoretycznie) |
| Temperatura inkubacji | 37°C (BPW, MKTTn), 41,5°C (RVS) |
| Specyficzność | >98% dla rodzaju Salmonella |
Norma
- Numer normy
- PN-EN ISO 6579-1:2017
- Tytuł (PL)
- Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania, oznaczania liczby i serotypowania Salmonella — Część 1: Wykrywanie Salmonella spp.
- Title (EN)
- Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 1: Detection of Salmonella spp.
Procedura krok po kroku
-
Przygotowanie próbki
Odważ 25 g próbki do worka stomachera. Dodaj 225 mL zbuforowanej wody peptonowej (BPW). Stosunek 1:10.
-
Homogenizacja
Homogenizuj w stomacherze przez 1–2 minuty (intensywność zależna od matrycy: mięso — dłużej, mleko — krócej).
-
Wstępne namnożenie
Inkubuj worek z próbką w BPW w 37±1°C przez 18±2 godziny. Cel: resuscytacja uszkodzonych komórek Salmonella.
-
Selektywne namnożenie — RVS
Przenieś 0,1 mL namnożenia do 10 mL bulionu RVS. Inkubuj 41,5±1°C przez 24±3 godziny.
-
Selektywne namnożenie — MKTTn
Przenieś 1 mL namnożenia do 10 mL bulionu MKTTn. Inkubuj 37±1°C przez 24±3 godziny.
-
Posiew na podłoża stałe
Z obu bulionów posiej oczkiem na agar XLD i drugie podłoże (BGA lub chromogenne). Inkubuj 24±3h/37°C.
-
Odczyt kolonii
Na XLD: kolonie typowe — różowo-czerwone z czarnym centrum (H₂S+) lub bez centrum (H₂S-). Na BGA: różowe-czerwone otoczone czerwoną strefą.
-
Izolacja czystych kultur
Wybierz min. 5 kolonii podejrzanych z każdego podłoża. Przesiej na agar odżywczy. Inkubuj 24h/37°C.
-
Potwierdzenie biochemiczne
TSI: skos zasadowy (K)/dno kwaśne (A), gaz +, H₂S +/-. Mocznik: ujemny. LDC: dodatnia. Indol: ujemny (zwykle). VP: ujemny.
-
Potwierdzenie serologiczne
Aglutynacja szkiełkowa z surowicami poliwartościowymi O i H. Reakcja dodatnia = zlep w ciągu 1 min.
-
Interpretacja wyników
Kolonia potwierdzona biochemicznie i serologicznie = Salmonella WYKRYTA w 25 g. Brak typowych kolonii lub negatywne potwierdzenie = NIE WYKRYTO.
-
Raportowanie
Wynik: "Salmonella spp. wykryto / nie wykryto w 25 g". Opcjonalnie: serotypowanie (S. Enteritidis, S. Typhimurium itd.).
Wymagany sprzęt i aparatura
| Sprzęt | Przykład | Orientacyjna cena |
|---|---|---|
| Inkubator 37±1°C | Memmert IN110, Binder BD 115, POL-EKO ST 2 | 5 000–15 000 PLN |
| Inkubator / łaźnia 41,5±1°C | Memmert WNB 14, łaźnia wodna GFL 1003 | 3 000–10 000 PLN |
| Stomacher (homogenizator) | Seward Stomacher 400 Circulator, BagMixer 400 | 12 000–25 000 PLN |
| Autoklaw | Tuttnauer 3870ELV, Systec VX-75 | 30 000–80 000 PLN |
| Komora laminarna klasy II | ESCO Airstream, Thermo MSC-Advantage | 25 000–60 000 PLN |
| Pipety automatyczne | Eppendorf Research Plus 1 mL + 10 mL | 800–2 000 PLN/szt. |
| Licznik kolonii | Interscience Scan 500, BZG 30 | 3 000–15 000 PLN |
Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne
| Odczynnik | CAS | Szczegóły |
|---|---|---|
| Zbuforowana woda peptonowa (BPW) | mieszanina | Pepton 10 g + NaCl 5 g + Na₂HPO₄ 3,5 g + KH₂PO₄ 1,5 g na litr. Merck 1.07228, Oxoid CM0509 |
| Bulion RVS (Rappaport-Vassiliadis) | — | Selektywny z zielenią malachitową i MgCl₂. Merck 1.07700, Oxoid CM0669. Inkubacja 41,5°C. |
| Bulion MKTTn (Müller-Kauffmann) | — | Z tetrathionianem, żółcią wołową i nowobiocyną. Merck 1.05878. Inkubacja 37°C. |
| Agar XLD (Xylose Lysine Deoxycholate) | — | Kolonie Salmonella: czerwone z czarnym centrum (H₂S+). Merck 1.05287, Oxoid CM0469. |
| Agar BGA (Brilliant Green Agar) | — | Drugie podłoże selektywne. Kolonie Salmonella: różowo-czerwone. Oxoid CM0329. |
| Agar odżywczy (Nutrient Agar) | — | Do izolacji czystych kultur, podłoże nieselektywne. |
| Podłoże TSI (Triple Sugar Iron) | — | Potwierdzenie: K/A z H₂S (skos zasadowy, dno kwaśne, czarny osad) |
| Podłoże mocznikowe (Christensen) | — | Salmonella — ujemna (brak hydrolizy mocznika, bez zmiany barwy) |
| Bulion lizyny dekarboksylazowej (LDC) | — | Salmonella — dodatnia (purpurowe zabarwienie) |
| Surowice poliwartościowe Salmonella O i H | — | bioMérieux, Denka Seiken — do aglutynacji szkiełkowej |
Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)
- Salmonella — patogen BSL-2! Praca wyłącznie w komorze laminarnej klasy II
- Rękawice nitrylowe, fartuch, okulary ochronne obowiązkowe
- Wszystkie odpady autoklawitować (121°C/20 min) przed utylizacją
- Dezynfekcja powierzchni roboczych po zakończeniu pracy (70% etanol lub chlor)
- Zgłoszenie wyników dodatnich do PPIS (Sanepid) — obowiązek prawny
Materiały szkoleniowe i filmowe
Najczęstsze pytania
Jaka norma opisuje to badanie?
Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO 6579-1:2017 — „Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda wykrywania, oznaczania liczby i serotypowania Salmonella — Część 1: Wykrywanie Salmonella spp.”. Tytuł angielski: „Microbiology of the food chain — Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella — Part 1: Detection of Salmonella spp.”.
Na czym polega ta metoda?
Metoda czterostopniowa oparta na hodowli klasycznej: 1. **Wstępne namnożenie (pre-enrichment)** — próbka w zbuforowanej wodzie peptonowej (BPW), 18h/37°C.
Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?
Wynik: Wykryto / Nie wykryto w 25 g (obecność/brak); Wielkość próbki: 25 g (lub inny określony w normie); Czas do wyniku: 4–5 dni roboczych; Granica wykrywania: 1 komórka / 25 g (teoretycznie).
Ile trwa wykonanie badania?
Suma czasów podanych przy poszczególnych etapach to około 4 dni 18 h 7 min. Procedura obejmuje 12 kroków.
Jaki sprzęt jest potrzebny?
Inkubator 37±1°C, Inkubator / łaźnia 41,5±1°C, Stomacher (homogenizator), Autoklaw, Komora laminarna klasy II, Pipety automatyczne, Licznik kolonii. Orientacyjny koszt podstawowej aparatury (Inkubator 37±1°C): 5 000–15 000 PLN.
Gdzie stosuje się to badanie?
Kontrola żywności gotowej do spożycia (Rozp. 2073/2005); Badanie mięsa drobiowego, wieprzowego, wołowego; Kontrola jaj i produktów jajecznych; Badanie warzyw, owoców, kiełków; Monitoring środowiskowy zakładów spożywczych (wymazy); Badanie pasz i surowców paszowych; Woda i środowisko (adaptacja metody).
Jakie środki ostrożności obowiązują?
Salmonella — patogen BSL-2! Praca wyłącznie w komorze laminarnej klasy II; Rękawice nitrylowe, fartuch, okulary ochronne obowiązkowe; Wszystkie odpady autoklawitować (121°C/20 min) przed utylizacją; Dezynfekcja powierzchni roboczych po zakończeniu pracy (70% etanol lub chlor); Zgłoszenie wyników dodatnich do PPIS (Sanepid) — obowiązek prawny.
Które laboratorium wykona to badanie?
Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN ISO 6579-1.