🧬 STEC/VTEC — E. coli werotoksyczne

Q: Jaka norma opisuje to badanie?

Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO/TS 13136:2013 — „Mikrobiologia żywności i pasz — Metoda reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność — Horyzontalna metoda wykrywania Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC) oraz oznaczania serogrup O157, O111, O26, O103 i O145”. Tytuł angielski: „Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups”.

Q: Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?

Namnażanie: 37 ± 1°C, 18–24 h w BPW lub mTSB + nowobiocyna; Metoda detekcji: Real-time PCR (qPCR) z sondami TaqMan; Geny wirulencji: stx1, stx2 (toksyny Shiga), eae (intimina); Serogrupy: O157, O111, O26, O103, O145.

Q: Ile trwa wykonanie badania?

Suma czasów podanych przy poszczególnych etapach to około 1 dni 23 h 40 min–2 dni 6 h 10 min. Procedura obejmuje 8 kroków.

Q: Jaki sprzęt jest potrzebny?

Termocykler real-time PCR, System IMS (separacja immunomagnetyczna), Wirówka laboratoryjna, Komora PCR (pre-PCR), Zestaw do ekstrakcji DNA, Inkubator 37°C, Komora laminarna klasy II. Orientacyjny koszt podstawowej aparatury (Termocykler real-time PCR): 60 000–180 000 PLN.

Q: Jakie środki ostrożności obowiązują?

STEC — patogen BSL-2 o ekstremalnie niskiej dawce zakaźnej (10–100 komórek!), stosować najwyższe środki ostrożności; Praca z kulturami wyłącznie w komorze laminarnej klasy II; Osobna strefa pre-PCR i post-PCR — zapobieganie kontaminacji amplikonami; Nowobiocyna — antybiotyk, unikać kontaktu ze skórą; Zużyte materiały i kultury autoklawować (121°C/30 min) przed utylizacją; W przypadku podejrzenia O157 — rozważyć powiadomienie laboratorium referencyjnego.

Q: Które laboratorium wykona to badanie?

Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN ISO 13136.

Mikrobiologia PN-EN ISO 13136

Krótko: o co chodzi

Wykrywanie E. coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC/VTEC) w żywności metodą real-time PCR — detekcja genów wirulencji (stx1, stx2, eae) i oznaczanie serogrup O157, O111, O26, O103, O145. Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO/TS 13136:2013; Namnażanie: 37 ± 1°C, 18–24 h w BPW lub mTSB + nowobiocyna. Procedura obejmuje 8 kroków (łącznie około 1 dni 23 h 40 min–2 dni 6 h 10 min); stosuje się je m.in. do: Kontrola kiełków i nasion do kiełkowania — Rozporządzenie (WE) 2073/2005, Badanie mięsa wołowego (mielone, steki, burgery), Kontrola niepasteryzowanego mleka i serów z mleka surowego.

W skrócie

Norma: PN-EN ISO/TS 13136:2013
Kategoria: Mikrobiologia
Kroków procedury: 8
Łączny czas etapów: 1 dni 23 h 40 min–2 dni 6 h 10 min
Namnażanie: 37 ± 1°C, 18–24 h w BPW lub mTSB + nowobiocyna
Metoda detekcji: Real-time PCR (qPCR) z sondami TaqMan
Geny wirulencji: stx1, stx2 (toksyny Shiga), eae (intimina)

Przegląd

STEC (Shiga toxin-producing Escherichia coli), znane również jako VTEC (Verocytotoxin-producing E. coli), to patogenne szczepy E. coli wytwarzające toksyny Shiga (Stx1 i/lub Stx2) — jedne z najgroźniejszych patogenów przenoszonych przez żywność. Zakażenie STEC może prowadzić do krwotocznego zapalenia okrężnicy (bloody diarrhea) i zespołu hemolityczno-mocznicowego (HUS — Hemolytic Uremic Syndrome) z niewydolnością nerek, małopłytkowością i niedokrwistością hemolityczną. Śmiertelność HUS wynosi 3–5%, a trwałe uszkodzenie nerek występuje u 25% dzieci z HUS.

Najgroźniejsze serogrupy (tzw. „Top 5" lub „Big 6") to: O157 (najczęstsza, najlepiej poznana), O26, O111, O103 i O145. Źródłem zakażenia jest najczęściej mięso wołowe (surowe lub niedogotowane), niepasteryzowane mleko, surowe kiełki (lucerna, brokuły), sałaty i woda. Dawka zakaźna jest ekstremalnie niska — wystarczy 10–100 komórek.

Norma PN-EN ISO/TS 13136 opisuje molekularną metodę wykrywania STEC opartą na real-time PCR. Jest to jedyna znormalizowana metoda PCR dla STEC w żywności. Metoda obejmuje: namnażanie próbki (18–24 h), ekstrakcję DNA, detekcję genów wirulencji (stx1, stx2 — geny toksyn Shiga; eae — gen intiminy, białka adhezji) oraz oznaczenie serogrup (O157, O111, O26, O103, O145) za pomocą PCR w czasie rzeczywistym.

Jeśli wykryto geny stx i eae oraz serotyp z „Top 5" — wymagana jest izolacja szczepu, często z wykorzystaniem separacji immunomagnetycznej (IMS). Badanie jest obligatoryjne w UE dla kiełków i nasion do kiełkowania (Rozporządzenie (WE) 2073/2005) oraz mięsa mielonego wołowego w niektórych krajach. Kryzys epidemiczny STEC O104:H4 w Niemczech w 2011 r. (kiełki kozieradki, >4000 zachorowań, 54 zgony) znacząco wzmocnił wymagania badawcze.

Zasada metody

Metoda trzyetapowa: (1) Namnażanie — próbkę inkubuje się w bulionie namnażającym (np. BPW lub mTSB z nowobiocyną) w 37°C/18–24 h. (2) Ekstrakcja DNA — z namnożonej kultury izoluje się DNA (termoliza lub zestawy ekstrakcyjne). (3) Real-time PCR — prowadzi się reakcje PCR w czasie rzeczywistym z sondami fluorescencyjnymi (TaqMan) do detekcji: genów stx1 i stx2 (toksyny Shiga), genu eae (intimina — adhezja do enterocytów), oraz genów serogrupowych (wzgA-O157, wzx-O111, wzx-O26, wzx-O103, wzx-O145). Jeśli próbka jest pozytywna na stx + eae + serogrupa „Top 5" — izoluje się szczep STEC, często przy pomocy IMS (immunomagnetic separation) z kulkami opłaszczonymi przeciwciałami anty-O.

Zastosowania

Kontrola kiełków i nasion do kiełkowania — Rozporządzenie (WE) 2073/2005
Badanie mięsa wołowego (mielone, steki, burgery)
Kontrola niepasteryzowanego mleka i serów z mleka surowego
Badanie sałat, warzyw liściastych i owoców (gotowych do spożycia)
Postępowanie epidemiologiczne w ogniskach HUS/krwotocznego zapalenia okrężnicy
Monitoring wody pitnej i wody rekreacyjnej
Kontrola żywności importowanej (zwłaszcza z krajów o wysokiej endemiczności)
Badania w ramach programów kontroli bezpieczeństwa żywności (RASFF)

Kluczowe parametry

Parametr	Wartość
Namnażanie	37 ± 1°C, 18–24 h w BPW lub mTSB + nowobiocyna
Metoda detekcji	Real-time PCR (qPCR) z sondami TaqMan
Geny wirulencji	stx1, stx2 (toksyny Shiga), eae (intimina)
Serogrupy	O157, O111, O26, O103, O145
Izolacja (opcjonalnie)	IMS (separacja immunomagnetyczna) + posiew na CT-SMAC / chromogenne
Czułość	1–10 jtk/25 g (po namnożeniu)

Norma

Numer normy: PN-EN ISO/TS 13136:2013
Tytuł (PL): Mikrobiologia żywności i pasz — Metoda reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność — Horyzontalna metoda wykrywania Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC) oraz oznaczania serogrup O157, O111, O26, O103 i O145
Title (EN): Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups

Procedura krok po kroku

Przygotowanie próbki i namnażanie

Odważ 25 g próbki, dodaj 225 mL bulionu namnażającego (BPW lub mTSB z nowobiocyną). Homogenizuj w stomacherze. Inkubuj 37 ± 1°C przez 18–24 h.

⏱ Czas: 18–24 h • 🌡 Temperatura: 37°C
Ekstrakcja DNA

Pobierz 1 mL namnożonej kultury. Wyizoluj DNA za pomocą zestawu ekstrakcyjnego (kolumny krzemionkowe, kulki magnetyczne lub termoliza: 100°C/10 min). Zmierz stężenie i czystość DNA (opcjonalnie).

⏱ Czas: 30–60 min
PCR screening — geny wirulencji

Przygotuj 3 reakcje PCR (simpleks lub multipleks): stx1, stx2, eae. Dodaj DNA, primery, sondy TaqMan, Master Mix. Program: 95°C/10 min → 40 cykli (95°C/15 s, 60°C/60 s). Analizuj krzywe fluorescencji — Ct < 35 = wynik pozytywny.

⏱ Czas: 90 min
PCR screening — serogrupy (jeśli stx+)

Jeśli wykryto stx1 i/lub stx2 — przygotuj 5 reakcji PCR dla serogrup: O157, O111, O26, O103, O145. Ten sam program termiczny. Wynik pozytywny = Ct < 35.

⏱ Czas: 90 min
Interpretacja screeningu

Warianty: (A) stx+ / eae+ / serogrupa Top5+ → próbka potencjalnie pozytywna, wymagana izolacja szczepu. (B) stx+ / eae− lub serogrupa ujemna → STEC obecne, ale nie Top5, raportuj. (C) stx− → próbka negatywna.
Izolacja szczepu (IMS)

Dla wariantu (A): dodaj 20 uL kulek immunomagnetycznych (anti-O odpowiedniej serogrupy) do 1 mL namnożonej kultury. Inkubuj 15–30 min z mieszaniem. Separuj na magnetsie. Płucz 3x. Posiej na CT-SMAC (O157) lub agar chromogenny.

⏱ Czas: 2 h
Potwierdzenie izolatu

Z płytki CT-SMAC/chromogennej wybierz typowe kolonie (O157: sorbitol-, bezbarwne). Potwierdź PCR — izolat musi posiadać stx1/stx2 + eae + odpowiedni gen serogrupowy. Opcjonalnie: aglutynacja lateksowa (anty-O157, etc.).

⏱ Czas: 24 h
Raportowanie

Wynik screeningu: „STEC (stx+) wykryto/nie wykryto w 25 g". Jeśli izolowano szczep: „STEC O157:H7 (stx2+, eae+) wyizolowano z 25 g próbki". Wynik pozytywny w żywności = powiadomienie RASFF.

⏱ Czas: 10 min

Wymagany sprzęt i aparatura

Sprzęt	Przykład	Orientacyjna cena
Termocykler real-time PCR	Bio-Rad CFX96 Touch, Applied Biosystems 7500 Fast, Roche LightCycler 480	60 000–180 000 PLN
System IMS (separacja immunomagnetyczna)	Dynabeads anti-E. coli O157 + separator magnetyczny (Dynal MPC-S)	5 000–15 000 PLN (separator) + 2 000–4 000 PLN/kit kulki
Wirówka laboratoryjna	Eppendorf 5424 R, Hettich Mikro 200 R	8 000–25 000 PLN
Komora PCR (pre-PCR)	Biosan UVT-S-AR, ESCO PCR Cabinet	5 000–15 000 PLN
Zestaw do ekstrakcji DNA	Qiagen DNeasy Food Kit, Promega Wizard, PrepMan Ultra	1 500–3 000 PLN / 50 ekstrakcji
Inkubator 37°C	Binder BD 56, Memmert INB 200	5 000–18 000 PLN
Komora laminarna klasy II	Thermo Scientific MSC-Advantage	25 000–60 000 PLN

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Odczynnik	CAS	Szczegóły
Zestawy real-time PCR dla STEC (stx1, stx2, eae)	—	Zestawy z primerami, sondami TaqMan i kontrolami: np. Bio-Rad iQ-Check STEC VirA, Romer RapidFinder STEC, Merck GeneDisc STEC; op. 96 reakcji
Zestawy PCR do serogrup (O157, O111, O26, O103, O145)	—	Osobne lub multipleksowe zestawy z primerami/sondami dla genów wzx/wzy; op. 96 reakcji
Master Mix PCR (polimeraza + dNTP + bufor)	—	Np. Bio-Rad SsoAdvanced Universal Probes Supermix, TaqMan Universal Master Mix; op. 200 reakcji
Zestaw do ekstrakcji DNA	—	Kolumny krzemionkowe lub kulki magnetyczne; np. Qiagen DNeasy, Promega Wizard; op. 50 ekstrakcji
mTSB + nowobiocyna (bulion namnażający)	—	Zmodyfikowany bulion tryptozowo-sojowy z nowobiocyną (20 mg/L) — selektywne namnażanie STEC; op. 500 g + suplementy
Kulki immunomagnetyczne (IMS)	—	Dynabeads anti-E. coli O157, O26, O111, O103, O145; op. 5 mL (50 reakcji)
CT-SMAC Agar (Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey)	—	Podłoże do izolacji E. coli O157 (sorbitol-ujemne); op. 500 g + suplementy
Woda peptonowa buforowana (BPW)	—	Alternatywny bulion namnażający, op. 500 g

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

STEC — patogen BSL-2 o ekstremalnie niskiej dawce zakaźnej (10–100 komórek!), stosować najwyższe środki ostrożności
Praca z kulturami wyłącznie w komorze laminarnej klasy II
Osobna strefa pre-PCR i post-PCR — zapobieganie kontaminacji amplikonami
Nowobiocyna — antybiotyk, unikać kontaktu ze skórą
Zużyte materiały i kultury autoklawować (121°C/30 min) przed utylizacją
W przypadku podejrzenia O157 — rozważyć powiadomienie laboratorium referencyjnego

Najczęstsze pytania

Jaka norma opisuje to badanie?

Badanie wykonuje się według normy PN-EN ISO/TS 13136:2013 — „Mikrobiologia żywności i pasz — Metoda reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność — Horyzontalna metoda wykrywania Escherichia coli wytwarzających toksynę Shiga (STEC) oraz oznaczania serogrup O157, O111, O26, O103 i O145”. Tytuł angielski: „Microbiology of food and animal feed — Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based method for the detection of food-borne pathogens — Horizontal method for the detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and the determination of O157, O111, O26, O103 and O145 serogroups”.

Na czym polega ta metoda?

Metoda trzyetapowa: (1) Namnażanie — próbkę inkubuje się w bulionie namnażającym (np. BPW lub mTSB z nowobiocyną) w 37°C/18–24 h.

Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?

Namnażanie: 37 ± 1°C, 18–24 h w BPW lub mTSB + nowobiocyna; Metoda detekcji: Real-time PCR (qPCR) z sondami TaqMan; Geny wirulencji: stx1, stx2 (toksyny Shiga), eae (intimina); Serogrupy: O157, O111, O26, O103, O145.

Ile trwa wykonanie badania?

Suma czasów podanych przy poszczególnych etapach to około 1 dni 23 h 40 min–2 dni 6 h 10 min. Procedura obejmuje 8 kroków.

Jaki sprzęt jest potrzebny?

Termocykler real-time PCR, System IMS (separacja immunomagnetyczna), Wirówka laboratoryjna, Komora PCR (pre-PCR), Zestaw do ekstrakcji DNA, Inkubator 37°C, Komora laminarna klasy II. Orientacyjny koszt podstawowej aparatury (Termocykler real-time PCR): 60 000–180 000 PLN.

Gdzie stosuje się to badanie?

Kontrola kiełków i nasion do kiełkowania — Rozporządzenie (WE) 2073/2005; Badanie mięsa wołowego (mielone, steki, burgery); Kontrola niepasteryzowanego mleka i serów z mleka surowego; Badanie sałat, warzyw liściastych i owoców (gotowych do spożycia); Postępowanie epidemiologiczne w ogniskach HUS/krwotocznego zapalenia okrężnicy; Monitoring wody pitnej i wody rekreacyjnej; Kontrola żywności importowanej (zwłaszcza z krajów o wysokiej endemiczności); Badania w ramach programów kontroli bezpieczeństwa żywności (RASFF).

Jakie środki ostrożności obowiązują?

STEC — patogen BSL-2 o ekstremalnie niskiej dawce zakaźnej (10–100 komórek!), stosować najwyższe środki ostrożności; Praca z kulturami wyłącznie w komorze laminarnej klasy II; Osobna strefa pre-PCR i post-PCR — zapobieganie kontaminacji amplikonami; Nowobiocyna — antybiotyk, unikać kontaktu ze skórą; Zużyte materiały i kultury autoklawować (121°C/30 min) przed utylizacją; W przypadku podejrzenia O157 — rozważyć powiadomienie laboratorium referencyjnego.

Które laboratorium wykona to badanie?