🦠 Vibrio spp. w żywności

Mikrobiologia PN-EN ISO 21872-1

Przegląd

Vibrio to rodzaj bakterii Gram-ujemnych, halofilnych (solnolubnych), naturalnie występujących w wodach morskich i estuariowych. Trzy główne gatunki enteropatogenne to: V. parahaemolyticus — najczęstsza przyczyna bakteryjnych zatruć pokarmowych związanych z owocami morza (biegunka, skurcze, gorączka, 12–24 h po spożyciu); V. cholerae — sprawca cholery (szczepy O1 i O139) oraz lżejszych gastroenteritów (szczepy nie-O1/nie-O139); V. vulnificus — najgroźniejszy gatunek, powodujący posocznicę o śmiertelności >50% u osób z chorobami wątroby.

Norma PN-EN ISO 21872-1 opisuje horyzontalną metodę wykrywania tych trzech gatunków Vibrio w żywności (głównie owoce morza: małże, ostrygi, krewetki, ryby) oraz próbkach środowiskowych. Metoda obejmuje namnażanie selektywne w alkalicznej zasolonej wodzie peptonowej (ASPW — Alkaline Saline Peptone Water), izolację na agarze TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar) i drugim podłożu selektywnym, oraz potwierdzenie biochemiczne i/lub molekularne (PCR).

ASPW zapewnia warunki alkaliczne (pH 8,6) i zasolone (NaCl 2–3%) sprzyjające wzrostowi Vibrio, jednocześnie hamując wiele innych bakterii. TCBS agar jest podłożem wysoce selektywnym — sole żółciowe i sacharoza różnicują gatunki Vibrio: V. parahaemolyticus (kolonie zielono-niebieskie, sacharoza-ujemny), V. cholerae (kolonie żółte, sacharoza-dodatni), V. vulnificus (kolonie zielone, sacharoza-ujemny).

Badanie Vibrio nabiera rosnącego znaczenia w związku z ociepleniem klimatu — Vibrio rozprzestrzeniają się na nowe akweny (Morze Bałtyckie, Morze Północne). W UE badanie jest wymagane w ramach kontroli urzędowej owoców morza i małży.

Zasada metody

Próbkę namnażamy w dwóch kolejnych porcjach ASPW (Alkaline Saline Peptone Water, pH 8,6, NaCl 2–3%). Pierwszy etap namnażania: 41,5°C/6 h i/lub 37°C/6 h. Drugi etap: przeniesienie do świeżego ASPW, 41,5°C/18 h (V. parahaemolyticus, V. cholerae) lub 37°C/18 h (V. vulnificus). Wysokie pH i zasolenie ASPW selektywnie promują wzrost Vibrio. Po namnożeniu posiewamy na TCBS agar (37°C/24 h) i drugie podłoże. Na TCBS V. parahaemolyticus tworzy zielono-niebieskie kolonie (sacharoza −), V. cholerae — żółte (sacharoza +), V. vulnificus — zielone (sacharoza −). Potwierdzenie: testy biochemiczne (oksydaza +, wzrost z NaCl, reakcja Voges-Proskauera) i/lub PCR (geny toksyn: tdh, trh dla V. parahaemolyticus; ctx dla V. cholerae).

Zastosowania

• Kontrola jakości owoców morza — małże, ostrygi, omułki, krewetki
• Badanie ryb i przetworów rybnych, szczególnie surowych (sushi, sashimi)
• Monitoring wody morskiej i estuariowej w rejonach pozyskiwania małży
• Kontrola urzędowa importowanych owoców morza
• Postępowanie epidemiologiczne w ogniskach zatruć po spożyciu owoców morza
• Monitoring klimatyczny — śledzenie rozprzestrzeniania Vibrio na nowe akweny (Bałtyk)
• Badanie sałatek i dań z owocami morza (gotowe do spożycia)

Kluczowe parametry

Norma

Numer normy

PN-EN ISO 21872-1:2017

Tytuł (PL)

Mikrobiologia łańcucha żywnościowego — Horyzontalna metoda oznaczania Vibrio spp. — Część 1: Wykrywanie potencjalnie enteropatogennych Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae i Vibrio vulnificus

Title (EN)

Microbiology of the food chain — Horizontal method for the determination of Vibrio spp. — Part 1: Detection of potentially enteropathogenic Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus

Procedura krok po kroku

1. Przygotowanie próbki

   Odważ 25 g próbki (owoce morza) do woreczka stomachera. Dodaj 225 mL ASPW (pH 8,6). Homogenizuj 60–120 s.

   ⏱ Czas: 10 min

2. Namnażanie — etap I

   Inkubuj w 41,5 ± 1°C przez 6 h (V. parahaemolyticus, V. cholerae). Równolegle możesz inkubować drugą porcję w 37 ± 1°C przez 6 h (V. vulnificus).

   ⏱ Czas: 6 h • 🌡 Temperatura: 41,5°C / 37°C

3. Namnażanie — etap II

   Przenieś 1 mL z namnożonej kultury do 10 mL świeżego ASPW. Inkubuj 41,5°C/18 h (V. parahaemolyticus, V. cholerae) lub 37°C/18 h (V. vulnificus).

   ⏱ Czas: 18 h • 🌡 Temperatura: 41,5°C / 37°C

4. Izolacja na TCBS

   Posiej eozę z namnożonego bulionu na płytkę TCBS agar i drugie podłoże selektywne (np. chromogenne). Inkubuj 37 ± 1°C przez 24 ± 2 h. UWAGA: TCBS agar NIE autoklawować — rozpuścić przez gotowanie i rozlać na płytki.

   ⏱ Czas: 24 h • 🌡 Temperatura: 37°C

5. Odczyt kolonii na TCBS

   Wyszukaj typowe kolonie: V. parahaemolyticus — zielono-niebieskie, 2–3 mm; V. cholerae — żółte, gładkie, 2–3 mm; V. vulnificus — zielone, 1–2 mm.

   ⏱ Czas: 15 min

6. Przesiew na podłoże nieselektywne

   Wybierz min. 3–5 typowych kolonii z każdej płytki. Przesiej na agar z NaCl (TSA + 1% NaCl). Inkubuj 37°C/24 h.

   ⏱ Czas: 24 h • 🌡 Temperatura: 37°C

7. Testy potwierdzenia

   Wykonaj: test oksydazy (+), test wzrostu z różnym stężeniem NaCl (0%, 3%, 6%, 8%, 10%), test fermentacji sacharozy, reakcja Voges-Proskauera, test string. Lub potwierdź PCR (geny: tlh/tdh/trh dla V. parahaemolyticus; ctx/ompW dla V. cholerae; vvhA dla V. vulnificus).

   ⏱ Czas: 24–48 h

8. Raportowanie

   Wynik: „V. parahaemolyticus / V. cholerae / V. vulnificus wykryto/nie wykryto w 25 g". Podaj gatunek i profil czynników wirulencji (jeśli wykonano PCR).

   ⏱ Czas: 10 min

Wymagany sprzęt i aparatura

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

• V. cholerae — patogen BSL-2 (szczepy nie-O1/O139) lub BSL-3 (O1/O139), przestrzegać wytycznych bezpieczeństwa biologicznego
• V. vulnificus — śmiertelność >50% u osób z chorobami wątroby, szczególna ostrożność przy skaleczeniach
• Praca wyłącznie w komorze laminarnej klasy II
• Sole żółciowe w TCBS — drażniące, stosować rękawice i okulary
• Zużyte materiały autoklawować przed utylizacją (121°C/20 min)
• Dezynfekcja powierzchni 70% etanolem — Vibrio wrażliwy na wysuszenie

Najczęstsze pytania