🍎 Witamina C — HPLC

Chemia żywności PN-EN 14130

Krótko: o co chodzi

Oznaczanie kwasu askorbinowego (witaminy C) w żywności metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detekcją UV. Badanie wykonuje się według normy PN-EN 14130:2004; Zakres oznaczania: 1–1000 mg/100 g. Procedura obejmuje 6 kroków (łącznie około 1 h 25 min); stosuje się je m.in. do: Kontrola etykietowania żywności — deklaracja wit. C (Rozp. UE 1169/2011), Badanie soków owocowych i warzywnych, Analiza wzbogaconej żywności i suplementów diety.

W skrócie

Norma: PN-EN 14130:2004
Kategoria: Chemia żywności
Kroków procedury: 6
Łączny czas etapów: 1 h 25 min
Zakres oznaczania: 1–1000 mg/100 g
Granica wykrywalności: 0,5 mg/100 g
Długość fali detekcji: 245 nm

Przegląd

Witamina C (kwas L-askorbinowy) jest niezbędnym składnikiem odżywczym, antyoksydantem i jednym z najczęściej deklarowanych składników na etykietach żywności. Metoda PN-EN 14130 jest referencyjną metodą chromatograficzną (HPLC-UV) przeznaczoną do oznaczania sumy kwasu askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego (po redukcji DTT) w produktach spożywczych.

Metoda polega na ekstrakcji witaminy C z próbki kwasem metafosforowym (stabilizator), redukcji formy utlenionej (DHAA) ditiotreitolem (DTT), rozdziale na kolumnie C18 z fazą ruchomą buforową i detekcji UV przy 245 nm. Zakres oznaczania: 1–1000 mg/100 g.

Zasada metody

Próbka jest homogenizowana z roztworem kwasu metafosforowego (HPO₃) zapobiegającym utlenianiu witaminy C. Po odwirowaniu supernatant jest traktowany DTT (ditiotreitol) w celu redukcji DHAA do kwasu askorbinowego. Roztwór jest filtrowany (0,22 µm) i analizowany HPLC na kolumnie C18 z fazą ruchomą: KH₂PO₄ 50 mmol/L, pH 2,5. Detekcja UV przy 245 nm. Ilościowe oznaczenie z krzywej kalibracyjnej (kwas L-askorbinowy, CRM).

Zastosowania

Kontrola etykietowania żywności — deklaracja wit. C (Rozp. UE 1169/2011)
Badanie soków owocowych i warzywnych
Analiza wzbogaconej żywności i suplementów diety
Kontrola jakości żywności dla niemowląt
Badanie trwałości — degradacja wit. C w czasie
Analiza owoców i warzyw świeżych i mrożonych

Kluczowe parametry

Parametr	Wartość
Zakres oznaczania	1–1000 mg/100 g
Granica wykrywalności	0,5 mg/100 g
Długość fali detekcji	245 nm
Precyzja (CV)	2–5%
Czas analizy	10–15 min/próbka

Norma

Numer normy: PN-EN 14130:2004
Tytuł (PL): Artykuły żywnościowe — Oznaczanie witaminy C metodą HPLC
Title (EN): Foodstuffs — Determination of vitamin C by HPLC

Procedura krok po kroku

Ekstrakcja

Odważ 5–10 g próbki. Dodaj 50 mL 3% HPO₃. Homogenizuj 2 min. Odwiruj 10 000 g / 10 min.

⏱ Czas: 15 min
Redukcja DHAA

Do 5 mL supernatantu dodaj 1 mL DTT (40 mg/mL). Inkubuj 30 min w ciemności w temp. pokojowej.

⏱ Czas: 30 min
Filtracja

Przefiltruj przez filtr 0,22 µm PVDF do fiolki HPLC.

⏱ Czas: 5 min
Kalibracja

Przygotuj wzorce kwasu askorbinowego: 5, 10, 25, 50, 100 mg/L w 3% HPO₃.

⏱ Czas: 20 min
Analiza HPLC

Kolumna C18, faza ruchoma: KH₂PO₄ 50 mM pH 2,5 + 2% MeOH, przepływ 1 mL/min, detekcja 245 nm.

⏱ Czas: 10 min
Obliczenia

Odczytaj stężenie z krzywej kalibracyjnej. Przelicz na mg/100 g próbki. Uwzględnij rozcieńczenie.

⏱ Czas: 5 min

Wymagany sprzęt i aparatura

Sprzęt	Przykład	Orientacyjna cena
System HPLC z detektorem UV/DAD	Agilent 1260 Infinity II, Shimadzu Nexera, Waters Alliance	200 000–400 000 PLN
Kolumna C18	Waters Atlantis T3 150×4,6 mm, 5 µm	2 000–4 000 PLN
Autosampler	Wbudowany w system HPLC	wbudowany
Wirówka laboratoryjna	Eppendorf 5804R, Hettich Rotina 380R	10 000–30 000 PLN
Homogenizator	IKA Ultra-Turrax T25, Kinematica PT 3100	5 000–15 000 PLN

Odczynniki, podłoża i materiały eksploatacyjne

Odczynnik	CAS	Szczegóły
Kwas L-askorbinowy (wzorzec)	50-81-7	Czystość ≥99%, certyfikowany CRM do kalibracji
Kwas metafosforowy HPO₃	37267-86-0	Roztwór 3–5%, stabilizator wit. C, zapobiega utlenianiu
Ditiotreitol (DTT)	3483-12-3	Reduktant DHAA → kwas askorbinowy, roztwór 40 mg/mL
Diwodorofosforan potasu KH₂PO₄	7778-77-0	Faza ruchoma: 50 mmol/L, pH 2,5 (zakwaszone H₃PO₄)
Metanol HPLC grade	67-56-1	Dodatek do fazy ruchomej (2–5%)

Bezpieczeństwo i higiena pracy (BHP)

Kwas metafosforowy — drażniący, rękawice i okulary ochronne
Metanol — toksyczny, łatwopalny. Pracować pod dygestorium.
DTT — drażniący, nieprzyjemny zapach. Pracować pod wyciągiem.
Odpady HPLC — zbierać oddzielnie (odpady organiczne)

Najczęstsze pytania

Jaka norma opisuje to badanie?

Badanie wykonuje się według normy PN-EN 14130:2004 — „Artykuły żywnościowe — Oznaczanie witaminy C metodą HPLC”. Tytuł angielski: „Foodstuffs — Determination of vitamin C by HPLC”.

Na czym polega ta metoda?

Jaki jest zakres pomiarowy i dokładność?

Zakres oznaczania: 1–1000 mg/100 g; Granica wykrywalności: 0,5 mg/100 g; Długość fali detekcji: 245 nm; Precyzja (CV): 2–5%.

Ile trwa wykonanie badania?

Suma czasów podanych przy poszczególnych etapach to około 1 h 25 min. Procedura obejmuje 6 kroków.

Jaki sprzęt jest potrzebny?

System HPLC z detektorem UV/DAD, Kolumna C18, Autosampler, Wirówka laboratoryjna, Homogenizator. Orientacyjny koszt podstawowej aparatury (System HPLC z detektorem UV/DAD): 200 000–400 000 PLN.

Gdzie stosuje się to badanie?

Kontrola etykietowania żywności — deklaracja wit. C (Rozp. UE 1169/2011); Badanie soków owocowych i warzywnych; Analiza wzbogaconej żywności i suplementów diety; Kontrola jakości żywności dla niemowląt; Badanie trwałości — degradacja wit. C w czasie; Analiza owoców i warzyw świeżych i mrożonych.

Jakie środki ostrożności obowiązują?

Kwas metafosforowy — drażniący, rękawice i okulary ochronne; Metanol — toksyczny, łatwopalny. Pracować pod dygestorium.; DTT — drażniący, nieprzyjemny zapach. Pracować pod wyciągiem.; Odpady HPLC — zbierać oddzielnie (odpady organiczne).

Które laboratorium wykona to badanie?

Badanie wykonują laboratoria akredytowane według ISO/IEC 17025. Na LabCoda wyszukasz je po numerze normy PN-EN 14130.

🔍 Znajdź laboratorium wykonujące to badanie